Proteólisis limitada de la P5A-ATPasa (SPF-1) de Saccharomyces cerevisiae

GERARDO R. CORRADI; GUIDO D. PETROVICH; HUGO P. ADAMO

Congreso; Protein Biophysics at the End of the World v2.0; 2017

Estructura y función de la P5A-ATPasas de Saccharomyces cerevisiae.La familia de transportadores activos conocidos como P-ATPasas (P1 a P5) es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis celular. Los sustratos transportados por P-ATPasas se restringen hasta el momento a iones y lípidos. P5 es el subgrupo menos estudiado de esta familia, y se presume que transporte un substrato aún desconocido. La pérdida de función de estas proteínas produce alteraciones en diversas funciones celulares y mutaciones en la P5-ATPasa humana, ATP13A2, ha sido asociada con el desarrollo de Enfermedad de Párkinson a temprana edad (Síndrome de Kufor Rakeb). Con el objetivo de avanzar en el conocimiento de la organización estructural de estas proteínas, se presentarán los resultados preliminares de experimentos de proteólisis parcial de la P5-ATPasa de levadura Spf1. Para esto usamos una purificación de la P5-ATPasa SPF1 de Saccharomyces cerevisiae y su versión fluorescente GFP-SPF1. SPF1 y GFP-SPF1 fueron expuestos a la acción de Tripsina, Quimotripsina y Proteinasa K. Los fragmentos resultantes fueron analizados por SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie Blue, medidas de intensidad de fluorescencia, espectrometría de masa de los fragmentos y Western Blot.En el congreso realizado en Río de Janeiro el año pasado (Latin American Protein Society Meeting) se mostró la presencia de una región sensible a proteólisis, ahora al comparar por SDS-PAGE la fragmentación en el tiempo con la fluorescencia de las bandas, se puede observar que la proteólisis comienza desde esta región cercana al carboxilo terminal hasta el amino terminal con todas las proteasas utilizadas. Por otro lado el ATP, único sustrato conocido de la SPF-1, ejerce un papel protector al exponerla a proteasas, este efecto es superior en ausencia de Magnesio (en presencia de EDTA). Para finalizar, al proteolizar la SPF-1 en presencia de fosfatidilinositol se estabiliza un fragmento de 100kDa, lo que sugeriría que esta proteína de membrana podría estar interactuando con fosfoinosítidos.