IQUIFIB   02644
INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Detección de Frataxina por ELISA en muestras de sangre: desarrollo y puesta a punto.
Autor/es:
CAROLINA VARELA; RALPH PIKIELNY; SANTIAGO E. FARAJ; ALEJANDRO FERRARI; NOELIA BALBI; JAVIER SANTOS
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; 2nd Congress of the Federation of Latin-American and Caribbean Societies for Neuroscience; 2016
Institución organizadora:
Federation of Latin-American and Caribbean Societies for Neuroscience
Resumen:
Introducción: La Ataxia de Friedreich es una enfermedadpoco frecuente, cuya incidencia es de 1/50.000 nacidosvivos. Se trata de la ataxia autosómica recesiva de mayorprevalencia mundial, y su causa es la mutación de ambosalelos codificantes para una proteína de localizacióneminentemente mitocondrial, denominada frataxina,cuya función está relacionada con el ensamblado de loscentros de hierro-azufre en otras proteínas mitocondriales.Las mutaciones más frecuentes (95-96% de los individuoscon Ataxia de Friedreich) para los alelos mencionados, sonlas expansiones de un triplete GAA localizado en el primerintrón, y el resultado es una disminución de la transcripciónde la secuencia, con la consecuente reducción en los nivelesde frataxina. El número de expansiones varía notablemente,desde algunas decenas hasta miles. El 4-5% restante de lospacientes son heterocigotas compuestos, que poseen unaexpansión en un alelo, combinada con alguna mutaciónpuntual en el otro. Las mutaciones puntuales son variadas,y poseen diferentes efectos según su posición, algunas deellas posiblemente también conduciendo a menores nivelesde la proteína madura. En relación con el tratamiento,una de las perspectivas más promisorias parece ser lapromoción del incremento de los niveles de frataxina, yasea aumentando su tasa de transcripción, impidiendosu degradación, o directamente administrándola comouna proteína exógena. En consecuencia, la mediciónde frataxina en muestras biológicas se convierte en unanecesidad diagnóstica, pero también en una herramientade monitoreo de las terapias futuras.Materiales y métodos: la detección de la molécula se realizómediante un ELISA competitivo en fase heterogénea,utilizando un suero de conejo anti frataxina humana.La competencia ocurrió entre la frataxina en solución(estándares de frataxina recombinante, o frataxinaen la muestra en estudio) y la frataxina en fase sólida(frataxina recombinante adherida a las placas multiwellde poliestireno). Los anticuerpos anti-frataxina libres seunieron a la placa, y fueron luego detectados utilizando unconjugado anti-conejo unido a peroxidasa, y su presenciarevelada empleando TMB como mezcla de sustrato/cromógeno. Tanto la frataxina recombinante como elsuero de conejo fueron producidos en nuestro laboratorio.Las muestras de sangre se tomaron por punción venosaen presencia de anticoagulante (heparina sódica), enadecuadas condiciones de asepcia. Las proteínas totalesfueron extraídas empleando buffer Tris con PMSF, EDTA yNP-40, y mantenidas luego a -70ºC hasta su uso. El contenidototal de proteína fue determinado empleando el métododel ácido bicinconínico, y las muestras procesadas porELISA. Los resultados se expresaron en términos de masa defrataxina relativizada a las proteínas totales. Los pacientesfirmaron un consentimiento por escrito, y el protocolo fueavalado por el Comité de Ética de FLENI y de la Facultad deFarmacia y Bioquímica (UBA).Resultados: El ensayo descripto se realizó en 20 individuossin signos clínicos de Ataxia de Friedreich, y en 33 individuoscon esos signos, y diagnóstico genético confirmatorio. Losresultados se muestran en la figura, y permiten afirmar queel ensayo tiene buena capacidad para discriminar entreunos y otros, y resulta una herramienta útil en el diagnósticocomplementario (por su bajo costo) y en el eventualseguimiento de terapias futuras.Conclusiones: Este desarrollo constituye una herramientacrucial para el diagnóstico complementario y para eleventual seguimiento de las terapias futuras de Ataxia deFriedreich, por su sencillez, bajo costo y rapidez de análisis.