Identificación genotípica de aislamientos de Azospirillum a través de diferentes métodos

GARCÍA J.; MARONICHE G.A.; CREUS C.; PERTICARI A.; GROPPA M.D.

Congreso; III Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2015

IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA DE AISLAMIENTOS DE AZOSPIRILLUM A TRAVÉS DE DIFERENTES MÉTODOSGarcía, J.E1., Maroniche, G.A.2,3, Creus, C.3, Perticari, A.1 y Groppa, M.D.41 Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMyZA), INTA-Castelar.2 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET)3 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP)4 Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. IQUIFIB, CONICET.Actualmente, existen diferentes métodos moleculares para la identificación y clasificación microbiana. La secuenciación parcial del gen del ARNr 16S es una herramienta universal que ha sido ampliamente empleada para el reconocimiento de géneros bacterianos; sin embargo, presenta ciertas limitaciones para discriminar grupos muy emparentados como especies y cepas por su lenta evolución; su variabilidad inter-génica entre las diferentes copias del genoma puede conducir a conclusiones inconsistentes. Otros genes pueden ser utilizados como alternativa, por ejemplo Mulet et al. (2009) encontraron que el gen rpoD es apropiado para un rápido genotipado de aislamiento en el género Pseudomonas gracias a su mayor tasa de evolución y grado de discriminación que el ARNr 16S. Para la discriminación a nivel cepa también se utilizan técnicas como el REP-PCR, RAPD, RISA, ARDRA, entre otras.El objetivo de este trabajo fue identificar genotípicamente 4 aislamientos de Azospirillum sp. pertenecientes a la Colección BPCV utilizando diferentes métodos moleculares.Los aislamientos se identificaron molecularmente a través de la secuenciación parcial del ARNr 16S y del gen rpoD. Además se realizó un análisis de huellas genéticas amplificando secuencias repetitivas presentes en el genoma bacteriano (BOX-PCR) para evaluar si los aislamientos corresponden a cepas diferentes. Para la secuenciación del ARNr 16S y para la BOX-PCR se utilizaron primers universales, mientras que para la secuenciación del gen rpoD se diseñaron primers específicos a partir de las secuencias genómicas de miembros del género disponibles. Las secuencias obtenidas se compararon con secuencias depositadas en la base de datos pública GenBank. Adicionalmente, se realizó un análisis filogenético con secuencias de cepas de referencia utilizando el método Maximum Likelyhood con una prueba de ?bootstrap? de 1000 repeticiones. Las huellas genéticas resultantes del BOX-PCR fueron analizadas utilizando el software PyElph y se construyó un árbol filogenético con el método UPGMA. Según el análisis filogenético de las secuencias tanto del ARNr 16S como del rpoD, los aislamientos Az19, Az3 y Az63 pertenecen a la especie A. brasilense que incluye las cepas Sp7 (cepa tipo) y Az39. Si bien estos dos métodos mostraron un alto grado de similitud entre Az19 y Az39, el análisis de las huellas genéticas obtenidas con el BOX-PCR se puede observar diferente patrón de bandas sugiriendo que son diferentes cepas. Respecto al aislamiento Az8 se observa una discrepancia entre el uso del gen rpoD y el ARNr 16S para definir su taxonomía. Según la secuencia del gen rpoD, Az8 presenta un alto grado de similitud a la cepa tipo de la especie A. dobereinerae mientras que, cuando se compara el ARNr 16S, presenta mayor similitud a la especie A. brasilense. Concordantemente, en el análisis por BOX-PCR este aislamiento presentó un patrón de bandas marcadamente diferente al resto de las cepas (Az3, Az19, Az39 y Az63) que parecen estar más relacionadas entre sí.En este trabajo, el empleo de la secuenciación del gen rpoD, permitió una discriminación más profunda de los aislamientos que el ARNr 16S. Si bien el BOX-PCR también permitió una mejor discriminación, es una técnica mucho más laboriosa y limitada ya que demanda la inclusión de cepas de referencia en cada corrida. Este método, sin embargo, presentó como limitante poca disponibilidad de secuencias de rpoD de diferentes especies de Azospirillum. En este sentido, la paulatina publicación de nuevas secuencias de rpoD de otros miembros del género permitirá contar con una herramienta rápida y confiable para una identificación de nuevos aislamientos de Azospirillum.