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26 PROPIEDADES FOTOTÓXICAS DE UNA FTALOCIANINA DE ZN(II) LIPOFÍLICA EN CÉLULAS DE CARCINOMA DE COLON NICOLÁS CHIARANTEA, JULIETA MARINOA, MARÍA C. GARCÍA VIOR B, ALEJANDRO SOSNIKC, JOSEFINA AWRUCHB, LEONOR ROGUINA aInstituto de Química y Fisicoquímica Biológicas, bDepartamento de Química Orgánica, cBIONIMED, Departamento de Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires nchiarante@gmail.com La terapia fotodinámica (PDT) utiliza un agente no tóxico, conocido como fotosensibilizador, el cual al ser excitado por luz visible en presencia de oxígeno genera especies citotóxicas que conducen a la muerte celular. Las ftalocianinas (Pc) constituyen una nueva generación de compuestos particularmente promisorios por presentar una absorción aproximandamente a 680 nm y ser eficierntes generadores de oxígeno singlete. La principal dificultad de estos compuestos es su tendencia a la agregación y su escasa solubilidad en condiciones fisiológicas, dando como resultado una baja biodisponibilidad y una disminución de su eficiencia fotodinámica. Con el propósito de encontrar ftalocianinas que puedan ser utilizadas como eficaces agentes fotosensibilizantes antitumorales, se estudiaron las propiedades fototóxicas de un ftalocianinato de Zn(II) lipofílico (Pc9) portador de cadenas alifáticas azufradas. Para mejorar la solubilidad en medios fisiológicos y prevenir agregaciones, Pc9 se incorporó a tres micelas de poloxamina con diferente grado de polimerización: T304, T904 y T1107. Puesto que las micelas T304 y T904 sin Pc9 resultaron ser citotóxicas, los estudios se prosiguieron con la preparación T1107. La eficacia antitumoral de Pc9 encapsulada en T1107 se evaluó en la línea celular CT26, derivada de un carcinoma de colon murino, con una dosis de luz de 2.8 Jcm-2. Pc9 presentó un potente efecto fototóxico con un valor de IC50 (concentración que inhibe el 50% la viabilidad celular) de 9.7 ± 4.6 nM. La comparación de este resultado con el efecto de Pc9 disuelta en DMSO 0,4% (IC50 0,12 ± 0,07 µM) permitió comprobar la mayor efectividad fotodinámica de la forma encapsulada, debido a una menor tendencia a la agregación. Con el fin de esclarecer el mecanismo de acción de la formulación Pc9-T1107, se examinó, en primer lugar, la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) en células CT26 irradiadas. Los niveles de ROS se estimaron con la sonda diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA), que se convierte en diclorofluoresceína fluorescente después de ser oxidada en el interior celular. Un incremento significativo en la producción de ROS se detectó a una concentración 10 nM de Pc9 vehiculizada en la micela T1107, mediante el empleo de un fluorómetro. La presencia de ROS también fue detectada por microscopía de fluorescencia en células tratadas con diferentes concentraciones de Pc9-T1107. Puesto que en un trabajo previo realizado en nuestro laboratorio demostramos que Pc9-T1107 internalizada en células KB, provenientes de un carcinoma orofaríngeo humano, se localiza preferencialmente en vesículas lisosomales, decidimos evaluar si Pc9 incorporada a la micela altera la permeabilidad de la membrana lisosomal en células CT26. Para ello, utilizamos el colorante fluorescente catiónico naranja de acridina, que emite fluorescencia naranja cuando se internaliza en organelas ácidas. Cuando las células CT26 se incubaron con Pc9-T1107 en la oscuridad se observó la típica señal de fluorescencia naranja, mientras que los núcleos se apreciaron verdes y difusos. Luego de la irradiación, se observó una marcada reducción de fluorescencia naranja en vesículas citosólicas, indicando un permeabilización parcial de la membrana lisosomal. Asimismo, la presencia de núcleos picnóticos sugirió el comienzo de una respuesta apoptótica. En concordancia con estos resultados, cuando se examinó la liberación de la enzima lisosomal catepsina D al citosol por ensayos de Western blot se detectó un incremento significativo en los niveles de catepsina D en la fracción citosólica luego de la incorporación y posterior irradiación de Pc 9-T1107. En conclusión, las primeras evidencias del estudio del mecanismo de muerte celular inducido por Pc 9 en células CT26 indican que la ftalocianina vehiculizada en la micela de poloxamina T1107 se comporta como un potente compuesto fototóxico, que induce la producción de ROS, aumenta la permeabilidad de la membrana lisosomal y favorece la liberación de proteasas al citosol. Aunque nuestros resultados sugieren que los lisosomas son organelas que participan en el proceso fotodinámico activado por Pc9, resta aún por determinar la secuencia de eventos desencadenados luego de la alteración lisosomal. Palabras clave: terapia fotodinámica, ftalocianina, micela, especies reactivas de oxígeno, lisosoma.