IQUIFIB   02644
INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Propiedades cinéticas de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) de L. major. Mapeo de su sitio activo por mutagénesis
Autor/es:
SOSA MÁXIMO,; NOWICKI , CRISTINA
Reunión:
Congreso; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2013
Resumen:
En TriTryps, la PEPCK es una enzima
glicosomal altamente conservada que contribuye a la producción de NAD+
y ATP en la organela. Al igual que sus homólogos de bacterias, levaduras y
plantas utiliza ATP/ADP, en cambio sus contrapartes de mamíferos dependen de GTP/GDP.
La estructura 3D de la enzima de T. cruzi
es prácticamente sobreimponible con la determinada para la enzima de E. coli, sin embargo como se carece de
estructuras con análogos de sustratos faltaría confirmar los residuos del sitio
activo participantes en la catálisis. Particularmente en Leishmania sp., las PEPCKs vincularían el metabolismo de
carbohidratos con el de aminoácidos y el ciclo de Krebs. Estas funciones no
serían equivalentes a lo largo del ciclo de vida de tripanosomas y leishmanias.
Observaciones de larga data indican que en L.
mexicana la actividad de PEPCK es mucho más elevada en extractos crudos de
amastigotes que en los del estadio del insecto. En este trabajo describimos las
propiedades cinéticas de la PEPCK de L.
major y mediante mutagénesis puntual realizamos un mapeo de los potenciales
residuos involucrados en la catálisis. La enzima recombinante expresada en E. coli presenta valores de Vmax de 67 ± 3.2 UE.mg-1
en el sentido de la formación de oxalacetato y 53 ± 2.6 UE.mg-1 cuando
cataliza la de formación de PEP. Para los sustratos de la primera reacción se
determinaron kms aparentes de 0.91, 0.09 y 12.3 mM para el
PEP, ADP y NaHCO3, respectivamente. En cambio para el OAA y ATP obtuvieron
valores de km aparentes de 0.09 y 0.05 mM. Las
sustituciones de los residuos Tyr180 por Phe y Ala junto con la de Arg43 por
Gln corroboraron la participación de los mismos en la correcta orientación del
PEP y la fijación del CO2. El cambio de la His205 por Gln puso en
evidencia la necesidad del grupo imidazol para la formación del complejo de
coordinación con el Mn2+, esto se reflejó en un aumento de más de
100 órdenes de magnitud en el km para ese cofactor.