Efecto de las Poliaminas y las P5-ATPasas sobre la viabilidad celular en Saccharomyces Cerevisiae

MARÍA CLARA SELLÉS; ADAMO HUGO.P.; CORRADI GERARDO R

Congreso; 26. XX Jornadas de Jóvenes Investigadores Asociación de Universidades Grupo Montevideo (AUGM): “La ciudadanía y el Desarrollo Social”; 2012

El envejecimiento es un proceso complejo que aun no es entendido completamente. A nivel celular las macromoléculas acumulan daños que provocan la pérdida de su función y el consecuente aumento de la sensibilidad a los efectos desfavorables del estrés. Algunos aspectos del envejecimiento son específicos de cada especie en tanto otros han sido evolutivamente conservados desde eucariotas simples, como las levaduras, hasta los vertebrados. Estudios recientes muestran que las proteínas de la familia P5-ATPasas modulan la respuesta celular al estrés. Diferentes evidencias sugieren que las P5-ATPasas participan en la generación de la respuesta a proteínas no correctamente plegadas (UPR, de unfolded protein response), una ruta de señalización de estrés que induce la expresión de genes que mejoran el plegamiento de las proteínas y su transporte, degrada proteínas no deseadas y limita la entrada al retículo endoplásmico de proteínas de la vía secretoria. En este sentido, se ha indicado que las P5-ATPasas cumplen funciones esenciales en 1) la modificación postraduccional de proteínas por glicosilación ,2) la formación de la pared celular,3) el transporte de proteínas al aparato de Golgi, 4) la orientación en la inserción de proteínas en la membrana, 5) la degradación de proteínas, 6) la sensibilidad a activadores de UPR. Las ATPasas de tipo P comprenden una gran superfamilia de proteínas, presentes tanto en procariotas como en eucariotas, que catalizan el transporte activo de cationes inorgánicos y otros sustratos a través de las membranas celulares. Se han dividido en cinco subfamilias denominadas tipo P1-P5 de acuerdo a su similitud de secuencia. La subfamilia menos estudiada es la de las ATPasas de tipo 5, la cual se expresa únicamente en eucariotas. En humanos existen 5 genes que codifican P5-ATPasas denominados ATP13A1-A5. Mutaciones que conllevan la perdida de función en ATP13A2 han sido asociadas con formas juveniles de la enfermedad de parkinson. S. cerevisiae contiene solo dos genes que codifican P5-ATPasas: Yel031w que codifica para la proteína SPF1 o Cod1p y que corresponde al grupo P5A, y Yor291w que codifica para la proteína YPK9 que pertenece al grupo P5B. La hipótesis de este trabajo es que la modificación de la respuesta al estrés por parte de las P5-ATPasas altera la sensibilidad a distintos agentes tóxicos y la viabilidad celular. El objetivo es establecer que relación existe entre los niveles de expresión (inactivación y sobreexpresión) de las P5-ATPasas y la perdida de viabilidad celular frente a un estimulo estresante. Se utilizaron cepas de Saccharomyces cerevisiae K.O. en Spf1 y YpK9 ( ΔSpf1 y Δ Ypk9 respectivamente), y otras que sobre expresan Spf1 y Ypk9. El control correspondiente es la cepa BY4741 (wild type). El envejecimiento cronológico de los cultivos se analizó en medios ricos compuestos por 0.75% P/V extracto de levadura, 0.625% P/V tripteina y 2.25% P/V glucosa y que fueron crecidos hasta alcanzar el estado estacionario. A diferentes tiempos se determino la viabilidad mediante el conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC). Como agente tóxico se utilizó espermidina agregada al medio de cultivo en una concentración de 4 mM al inicio del cultivo (tiempo 0). A los 2, 5, 11 y 20 días se observó que la presencia de espermidina estimuló 1.5 veces el crecimiento de la cepa wild type en tanto que las cepas ΔSpf1 y Δ Ypk9 fueron mínimamente afectadas. La viabilidad de las cepas ΔSpf1 y Δ Ypk9 fue aparentemente menor que la wild type, efecto que se acentuó en presencia de 4 mM de espermidina. Por otro lado, se analizo la respuesta al estrés térmico por incubación a 42°C por 4 horas (Heat Shock) en presencia de espermidina: 0 mM, 4 mM y 10 mM. El shock térmico disminuyo la viabilidad en todas las cepas, siendo ΔSpf1 y Δ Ypk9 las más afectadas. El tratamiento con espermidina potenció la disminución de viabilidad debido a la temperatura. En consistencia con estos resultados la velocidad de crecimiento en medios sólidos de ΔSpf1 y principalmente de ΔYpk9 fueron menores que la de cepa wild type luego del shock térmico. Los resultados muestran que la delación de los genes de P5-ATPasas en Saccharomyces cerevisiae eliminan el efecto protector de bajas concentraciones de espermidina y aumenta su efecto toxico. Así mismo el tratamiento térmico potencia el efecto toxico de la espermidina siendo nuevamente ΔSpf1 y Δ Ypk9 las cepas más afectadas. Estos resultados sugieren que las P5-ATPasas son necesarias para mantener la viabilidad frente a situaciones de estrés y que la pérdida de su función acelera el envejecimiento cronológico de S. cerevisiae.