Homeostasis del ATP extracelular (ATPe) en eritrocitos de Xenopus laevis

BADORREY MS, LEAL DENIS MF, INCICCO JJ, MONTALBETTI N, ESPELT MV, SCHWARZBAUM PJ

Rosario

Congreso; Reunion anual de la Sociedad Argentina de Fisiologia; 2012

SAFIS

Los eritrocitos de Xenopus laevis constituyen un modelo celular para el estudio de procesos de transporte transmembrana de nucleótidos. Se sabe que estas células liberan ATP al medio extracelular frente a diversos estímulos y que la concentración de ATP extracelular ([ATP]e) podría ser1- La salida de ATP mediada por pannexina 1 o por exocitosis, lo que lleva a un aumento de la [ATP]e 2- La hidrólisis extracelular de ATPe por actividad ectoATPasa, lo que lleva a una disminución en la [ATP]e. El objetivo del presente trabajo es analizar los mecanismos que regulan la [ATP]e utilizando eritrocitos de Xenopus estimulados con mastoparán 7 (MST7), un péptido que se intercala en la membrana celular y activa proteínas G triméricas. La [ATP]e fue cuantificada de manera continua por el sistema luciferina-luciferasa, mientras que la actividad ectoATPasa fue estimada a partir de la liberación de [γ-32P]Pi a partir de [γ-32P]ATP. Las células fueron sembradas sobre cubreobjetos con poli-D-lisina (células adheridas) o sin poli-D-lisina (células no adheridas). Para identificar las vías de salida de ATP las células fueron preincubadas con brefeldina A (inhibidor de la exocitosis) o carbenoxolone (inhibidor de Pannexina 1). Resultados: - Tanto en presencia como en ausencia de adhesión celular, el MST7 produjo un aumento significativo de la [ATP]e, pero en células adheridas este aumento fue 8,7 veces superior al obtenido con células no adheridas. - En células adheridas, la exposición a carbenoxolone redujo la salida de ATPe en 19%, mientras que la brefeldina A no indujo cambios significativos. - Se observó una importante actividad ectoATPasa (1,2 ± 0,2 pmoles/106 cel/min a 1 μM ATP), que fue 45 veces superior a la de eritrocitos humanos. Se construyó un modelo matemático para, mediante ajuste a los datos experimentales, cuantificar la importancia relativa de la salida de ATP y la hidrólisis de ATPe en la regulación del ATPe. Además el modelado permitió determinar el perfil cinético de los flujos de ATP que median la salida de ATP. Conclusiones: en eritrocitos de Xenopus la adhesión celular constituye un importante preestímulo para la liberación de ATP mediada por MST7. La inhibición parcial de la salida de ATPe con carbenoxolone indica que la pannexina 1 participa en el transporte de ATP, mientras que la exocitosis no sería un mecanismo importante. El incremento en la [ATP]e inducido por el MST7 es contrarrestado en parte por la actividad ectoATPasa. Con subsidios UBACYT (20020100100090), CONICET (PIP1187) y ANPCyT (0151).