Uso de la GFP fusionada al transportador SLC35A3 como herramienta para la optimizacion de la expresion en E. coli

PUJOL ML; POSSE ML; BREDESTON LM

Buenos Aires

Congreso; XL Reunion Anual Sociedad Argentina de Biofisica; 2011

Sociedad Argentina de Biofisica

Una de las principales limitantes en los estudios de estructura-función de proteínas de membrana eucariotas (PME) es la expresión de cantidades adecuadas en sistemas heterólogos. La fusión de potenciales PME a la GFP (green fluorescent protein) constituye una novedosa metodología (1) que permite un seguimiento simple y rápido de las condiciones de expresión y purificación evitando los habituales métodos que son más laboriosos. En este trabajo mostramos la aplicación de esta metodología para la expresión en E. coli del transportador de nucleótido-azúcar SLC35A3 (específico para UDP-GlcNac en el aparato de Golgi). Para ello se ensayaron diferentes condiciones tales como: homólogos de SLC35A3 de diferente origen, tipo de plásmido, cepa de E. coli huésped, temperatura de incubación, medio de cultivo, momento de inducción, tipo de inductor, y tiempo de inducción. Finalizada cada una de las condiciones se midió la DO a 600nm para estimar el crecimiento del cultivo. Luego el pellet (correspondiente a 1ml de cultivo) se resuspendió en 200 ul de Tris-HCl 50 mM, glicerol 10%, EDTA 2mM y se midió la fluorescencia (Ex 488nm Em 512nm) de las células enteras como indicador de la producción de SLC35A3-GFP. La comparación de los resultados obtenidos bajo diferentes condiciones mostró que la expresión fue máxima cuando se utilizaron: células Rossetta2 plys transformadas con el plásmido pPRIBA1-MmSLC35A3 en medio 3.2Y e inducidas a una DO600=0.5 con lactosa 0.02% por 24hs a 20oC. Por otro lado el hecho de que la GFP se encuentra fusionada al C-terminal, asegura que el transportador ha sido sintetizado previamente. Además como la GFP adquiere un correcto plegado sólo en el citoplasma (y no en el periplasma) se deduce que el extremo C-terminal de MmSLC35A3 tiene una orientación hacia ese compartimento. Finalmente, los resultados preliminares de la separación por SDS-PAGE de las proteínas provenientes de membranas expresando MmSLC35A3-GFP confirmaron una banda correspondiente a la proteína de fusión por fluorescencia en gel. 1.Drew et al. (2006) Nature Methods 3, 303-313 Con subsidios del CONICET.