IQUIFIB   02644
INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Hidrólisis de ATP por la Na+,K+-ATPasa en condiciones de single turnover.
Autor/es:
J. MATÍAS STOPIELLO; SB. KAUFMAN; RODOLFO M GONZÁLEZ LEBRERO
Reunión:
Congreso; XL reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2011
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Biofísica
Resumen:
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La bomba de sodio-potasio
(Na+,K+-ATPasa) es una proteína integral de membrana de células
eucariotes que exporta tres Na+ desde el interior celular e importa
dos K+ desde el medio extracelular empleando como fuerza impulsora la
energía libre de la reacción de hidrólisis de ATP. El ciclo de
trabajo de la Na+,K+-ATPasa se inicia con la unión de una molécula
de ATP y tres iones Na a la bomba. Se produce luego la hidrólisis de
ATP que rinde ADP y ortofosfato y este último fosforila la enzima en
su conformación E1 (E1P). Un cambio conformacional ulterior
transforma el intermediario E1P en E2P que, en ausencia de K+, se
desfosforila espontáneamente liberando ortofosfato (Pi) y
recuperando su conformación E1. Se completa así el denominado ciclo
de reacción de la Na+-ATPasa. Al menos dos de los pasos de esta
secuencia de reacciones son objeto de múltiples controversias: la
unión de ATP en presencia de Mg2+ y la reacción de interconversión
entre E1P y E2P. Con el propósito de obtener las constantes de
velocidad que caracterizan ambas etapas del ciclo realizamos
experimentos midiendo el curso temporal tanto de la liberación de Pi
como de la cantidad de fosfoenzima durante la hidrólisis de ATP del
ciclo de la Na-ATPasa. Dichos experimentos fueron realizados variando
las concentraciones de enzima y ATP, pero en todos los casos con
exceso de enzima respecto del sustrato (single turnover).
Observamos que la cantidad de Pi medido como función del tiempo
aumenta monoexponencialmente en todas las condiciones ensayadas. La
constante aparente de dicha exponencial aumentó linealmente con la
concentración de enzima (1,331,7 nM) y resultó independiente de
la concentración de ATP. Esto indica que en las condiciones
experimentales ensayadas la reacción de hidrólisis progresa bajo
condiciones de pseudo primer orden respecto de la enzima. Por otro
lado, la cantidad de fosfoenzima medida como función del tiempo
aumentó hasta alcanzar un máximo para luego decrecer hasta valores
distintos de cero. Estas curvas presentan la forma característica de
intermediarios de reacción en un mecanismo de reacción consecutivo.
Estos resultados indican que la estrategia experimental adoptada
posibilita estudiar la secuencia de reacciones de la Na+-ATPasa y
obtener las constantes de velocidad que lo caracterizan.