Análisis biológico de sistemas nanométricos para vehiculización de siRNA constituidos por lecitina.

YAMILA GÁNDOLA; SEBASTIÁN PÉREZ; ADRIANA CARLUCCI; CARLOS BREGNI; LORENA GONZÁLEZ

La Plata, Buenos Aires

Simposio; 1er Simposio Latinoamericano de Nanomedicinas; 2010

INTRODUCCIÓN: El silenciamiento de genes por interferencia con RNA (RNAi) es un proceso biológico natural que implica la obstrucción de la traducción de genes con pequeños fragmentos de RNA (siRNA) (Fire A, 1998; Hannon GJ, 2002). Los siRNA podrían dirigirse a prácticamente cualquier gen del genoma humano, con lo cual tendrían un potencial ilimitado para el tratamiento de enfermedades, ello ha promovido el desarrollo de reactivos basados en los RNAi para su aplicación clínica. La formulación de estos oligonucléotidos para su administración in vitro y mucho más aún in vivo constituye actualmente un desafío para la utilización terapéutica exitosa de los siRNA. Factores como la potencia inhibitoria de los siRNA, su especificidad génica y estabilidad son cuestiones fundamentales a tener en cuenta para el diseño de siRNA para uso terapéutico (de Fougerolles A, 2007). La lecitina es una mezcla de fosfolípidos enriquecida en fosfatidilcolina (98% p/p). La lecitina y los fosfolípidos purificados que la componen son ampliamente utilizados con propósitos farmacotécnicos formando parte de liposomas, micelas mixtas o emulsiones submicrónicas. En el presente trabajo se analiza la citotoxicidad, capacidad de unión de siRNA y la capacidad de vehiculización intracelular de siRNA por parte de dispersiones acuosas de lecitina con el fin de establecer la utilidad de estos fosfolípidos para el diseño de formulaciones eficientes como carriers de siRNA. METODOLOGÍA: Lecitina (Phospholipon 90G, Lipoid, Germany) se dispersó en distintos buffers y soluciones, todos ellos isotónicos, resultando en sistemas nanométricos. Por medio de electroforesis en geles de agarosa se analizó la capacidad de unión de siRNA de las dispersiones en diferentes relaciones N/P. La citotoxicidad de las dispersiones se evaluó por medio de un ensayo para determinar viabilidad celular basada en la reducción del cloruro de tetrazolium. Finalmente, la captación celular se evaluó analizando la transfección de siRNA marcado con un fluorocromo y evaluando su distribución intracelular por medio de microscopia de fluorescencia. RESULTADOS: Los ensayos de viabilidad celular demostraron que ninguna de las concentraciones de lecitina utilizadas es citotóxica, tampoco se vió afectada la viabilidad celular con la composición del medio en el que se realizó la dispersión de lecitina. En cuanto a la capacidad de unión de siRNA de las dispersiones de lecitina, se puso en evidencia la importancia del medio de solubilización para favorecer la unión del siRNA. Sin embargo, no fue determinante la relación N/P, ya que las dispersiones de lecitina capaces de unir siRNA se asocian a los oligonucléotidos en un amplio rango de relaciones N/P. Finalmente los estudios de microscopía de fluorescencia evidenciaron la capacidad de las dispersiones de lecitina de internalizar siRNA. CONCLUSIONES: Los estudios realizados sugieren la utilización de sistemas nanométrcios compuestos por lecitina para el diseño de formulaciones destinadas a vehiculizar siRNA. - de Fougerolles A et al. 2007 Nat Rev Drug Discov. 6: 443-53. - Fire A, et al. 1998. Nature. Feb 19;391(6669):806-11. - Hannon GJ. 2002. Nature. Jul 11;418(6894):244-51.