Informe de la Campaña al AMP Namuncurá - Banco Burdwood: Bentos

ANDREA MALITS

2016-03-26/2016-04-25

149-152

Biológica

Rec.Hidr.-Cuencas oceanicas

Funcionamiento de la red trófica microbiana con énfasis en el papel de la lisis vírica para el control de la producción y diversidad de procariotas:El objetivo general es continuar los estudios sobre aspectos microbianos que incluyan factores que afecten la producción y diversidad de microorganismos, su interacción con los parámetros fisicoquímicos y sus implicaciones para los flujos biogeoquímicos en el AMP N/BB y aguas aledañas que se iniciaron en primavera 2014 a bordo del B/O Puerto Deseado.Objetivos específicos:1.Determinar la biomasa autótrofa y las concentraciones de nutrientes inorgánicos disueltos en el AMP N/BB y zonas aledañas para caracterizar el estado trófico de las masas de agua.2.Determinar las variaciones espaciales de las abundancias de microorganismos (pico/nanoplancton autótrofo, nanoflagelados heterótrofos, procariotas heterótrofas y virus) y relacionarlas con los parámetros físico-químicos y la biomasa autótrofa.3.Explorar la diversidad procariota y vírica a partir de herramientas de secuenciación masiva del AMP N/BB, Canal Beagle y aguas aledañas.4.Evaluar el papel de la lisis vírica para el control de la biomasa y diversidad de procariotas en estaciones selectas (AMP N/BB, Canal Beagle y áreas aledañas) y relacionar la variabilidad espacial de la lisis vírica con los parámetros físico-químicos y el estado trófico de las masa de agua.Metodología:En 29 estaciones se tomaron muestras de agua subsuperficial (10 m de profundidad) mediante una botella Niskin de 25L, de aguas profundas mediante una botella Niskin de 5L (cerca del fondo excepto E16, E19, E20 y E21) y en tres estaciones de ellas en aguas intermedias para obtener los parámetros que se detallen en la Tabla 1. Las botellas Niskin se operaron desde el guinche oceanográfico junto al CTD SBE-19 y se cerraron manualmente con una mensajero.1. Concentración de clorofila y nutrientes inorgánicosPara los análisis de clorofila, se filtraron 2-3L sobre filtros Whatman GF/F que se guardarán a -20 ºC hasta su procesado. Los pigmentos fotosintéticos se extraerán en acetona 90% durante 24h y se determinarán con un espectrofotómetro en el CADIC, según Strickland & Parsons (1972). Dos submuestras de 250mL del agua previamente filtrada por GF/F se guardaron a -20 ºC para los análisis de la concentración de nutrientes inorgánicos disueltos (amonio, nitrito, nitrato, fosfatos y silicatos) en un laboratorio habilitado.2. AbsorbanciasPara el estudio cualitativo de la MOD se obtendrán las características ópticas de las muestras de agua pre-filtradas por filtros de fibra de vidrio Whatman GF/F con un espectrofotómetro Cintra 10e (GBC) UV-Vis con un escaneo continuo entre 200 y 800 nm longitud de onda y las absorbancias de longitud de onda especificas a 250 nm, 254 nm, 365 nm y 440 nm. La absorbancia a 254 nm da una estimación de la concentración de materia orgánica en el agua. El cociente entre las absorbancias a 250 nm y 365 nm da el valor del índice E2:E3 que es una estimación de la cantidad relativa de la MOD según su peso molecular; el índice aumenta con el aumento de la fracción del MOD de bajo peso molecular. El coeficiente de absorción a 440 nm (g440) indica el contenido de sustancias húmicas en el agua (Kirk, 2011).3. Abundancias microbianasSubmuestras pre-filtradas por una malla de 115 µm para excluir el mesoplancton para la abundancia, biomasa y composición (grandes grupos taxonómicos y funcionales) de pico-/nanoplancton fototrófico, nanoflagelados heterótrofos (5mL, respectivamente), procariotas y virus (1mL, respectivamente) fueron fijadas con glutaraldehido, previamente filtrado por 0.2µm, a una concentración final de 0.5% (excepto para el pico/nanoplancton fototrófico, cual era 0.1%), incubadas 20-30 minutos a 4ºC, a continuación congeladas en nitrógeno liquido y almacenadas a ?20ºC para su posterior análisis por citometría de flujo. Detalles prácticos se encuentran en Brussaard (2004) para virus, en Gasol & del Giorgio (2000) para procariotas y en Marie et al. (2001) para pico-/nanoplancton autótrofo. La abundancia de nanoflagelados heterótrofos será determinada con un protocolo optimizado (Christaki et al., 2011) y usado recientemente para muestras del Atlántico Sudoccidental (Malits, datos sin publicar).3. Diversidad procariotaJunto al muestreo de datos biológicos y fisicoquímicos se obtuvieron muestras ADN vírica y ADN procariota para la posterior secuenciación del 16S rRNA gen amplicón aprovechando herramientas de secuenciación masiva.Para obtener el ADN procariota 2-4L de agua se concentraron mediante una bomba peristáltica sobre filtros de policarbonato (0.2µm y 3µm de tamaño). El ADN será extraído usando un kit de extracción MoBio PowerWater® DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Inc., CA, USA) siguiendo los instrucciones del proveedor. Las comunidades víricas de 2-4L de agua pre-filtrada por 0.2µm fueron concentradas mediante filtración tangencial con un cartucho de 30-kDalton (VIVAFLOW 200) a 35mL y guardado a 4°C hasta su procesado. Los virus se concentraran hasta 500 µL centrifugando con 30-kD filters (Amicon Ultra-15; Millipore). Un servicio de secuenciación masiva realizará la preparación de la librería de ADN y la secuenciación.4. La mortalidad procariota por lisis virica.La producción vírica lítica (VP) y la fracción de células infectadas (FIC) se estimaron mediante una técnica de dilución que se basa en el principio de reducir la abundancia de virus para impedir nueva infección. Entonces, los virus producidos son de células ya infectadas (Weinbauer et al., 2010). En estaciones listadas en la Tabla 1, las muestras de agua obtenidas de 10 m de profundidad mediante la botella Niskin y prefiltradas por una malla de 115 µm se fraccionaron mediante un sistema de flujo tangencial equipado con cartuchos de 0.2 µm y de 30 kDalton para obtener un concentrado de procariotas y agua libre de virus, respectivamente. Los procariotas fueron incubados en agua libre de virus durante 9 horas a la temperatura in situ y se tomaron muestras para las abundancias vírica y procariota a tiempo 0 y cada 3 horas que se preservarán para su posterior análisis por citometría de flujo.Bibliografía:Binder, B. Reconsidering the relationship between virally induced bacterial mortality and frequency of infected cells. Aquat. Microb. Ecol. 18, 207?215 (1999).Brussaard, C. P. D. Optimization of Procedures for Counting Viruses by Flow Cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 70, 1506?1513 (2004).Christaki, U. et al. Optimized routine flow cytometric enumeration of heterotrophic flagellates using SYBR Green I. Limnol. Ocean. Methods 9, 329?339 (2011).Gasol, M. J. & del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Sci. Mar. 64, 197?224 (2000).Kirk, J. T. O. Light and Photosynthesis in Aquatic Ecosystems. (Cambridge University Press, 2011).Marie, D., Partensky, F., Vaulot, D. & Brussaard, C. Enumeration of phytoplankton, bacteria, and viruses in marine samples. Curr Protoc Cytom Chapter 11, Unit 11 11 (2001).Strickland, J. D. H. & Parsons, T. R. A practical manual of seawater analysis. Bull. Fish. Res. Board Canada 167, (1972).Weinbauer, M. G., Rowe, J. M. & Wilhelm, S. W. in Manual of Aquatic Viral Ecology (eds. Suttle, C., Wilhelm, S. W. & Weinbauer, M. G.) 1?8 (ASLO, 2010).