Informe de Campaña "Área Marina Namuncurá-Banco Burdwood", 4 al 27 de noviembre 2014

ANDREA MALITS

2014-11-04/2014-11-27

23-30

Biológica

Rec.Hidr.-Cuencas oceanicas

El objetivo general es el estudio del funcionamiento de la red trófica microbiana y sus repercusiones para los flujos biogeoquímicos en el Canal Beagle y Atlántico Sudoccidental. Para lograr este objetivo se proponen los objetivos específicos siguientes: 1. Determinar las variaciones espaciales de las abundancias de microorganismos (pico-/nanoplancton autótrofo, nanoflagelados heterótrofos, procariotas heterótrofas, virus) y relacionarlas con los parámetros fisicoquímicos y la biomasa autótrofa en el Canal Beagle y Banco Burdwood (Atlántico Sudoccidental). 2. Evaluar la mortalidad de procariotas debida a virus y/o nanoflagelados en estaciones influidos por diferentes condiciones ambientales en el Canal Beagle y en aguas atlánticas en una grilla de estaciones para determinar las variaciones espaciales de los factores dominantes que controlen la producción procariota y en ultima instancia, el destino del carbono orgánico. METODOLOGÍA Se muestrearon 21 estaciones para abundancias microbianas a las profundidades maximas de la estación, a 10m y a un pronunciado máximo de clorofila (1-50m) si existente (Tabla 1). En 8 de las estaciones se hicieron experimentos de producción vírica lítica y lisogénica con muestras de agua de 10m, en 5 de estas se evaluaron las tasas de crecimiento de procariotas y la mortalidad de procariotas por depredación por nanoflagelados heterótrofos (Tabla 1). Durante un fondeo en la bahía San Juan de Salvamento de la isla de los Estados por impedimentos meteorológicos se realizó un ciclo diario de muestreo con un muestreo cada 6 horas durante 24 horas para abundancias microbianas y experimentos de mortalidad y crecimiento de procariotas (E21B, Tabla 1). Las muestras se tomaron con una botella Niskin de 25L y se prefiltraron por una malla de 115µm para excluir el mesoplancton. Las muestras fueron inmediatamente fijadas para su posterior analisis de abundancias microbianas o utilizadas en experimentos de producción lítica y lisogénica, depredación por nanoflagelados y tasas de crecimiento de procariotas. Abundancias microbianas. Submuestras para la abundancia, biomasa y composición (grandes grupos taxonómicos y funcionales) de pico-/nanoplancton fototrófico, nanoflagelados heterótrofos (5mL, respectivamente), procariotas y virus (1mL, respectivamente) fueron fijadas con glutaraldehido, previamente filtrado por 0.2µm, a una concentración final de 0.5% (excepto para el pico/nanoplancton fototrófico, cual era 0.1%), incubadas 20-30 minutos a 4ºC, a continuación congeladas en nitrógeno liquido y almacenadas a ?20ºC para su posterior análisis por citometría de flujo. Detalles prácticos se encuentran en (Brussaard, 2004) para virus, en (Gasol & Del Giorgio, 2000) para procariota y en (Marie et al., 2001) para pico-/nanoplancton autótrofo. La abundancia de nanoflagelados heterótrofos será determinada con un protocolo optimizado (Christaki et al., 2011) y usado recientemente para muestras marinas del Atlántico Suroccidental (Malits, datos sin publicar). Producción vírica y mortalidad de procariotas por virus. La producción vírica lítica (VPl), la fracción de células infectadas (FIC), la producción vírica inducida (lsogénica) (VPi) y la fracción de células lisogénicas (FLC) se estimaran mediante una técnica de dilución (Weinbauer et al., 2010) que se basa en el principio de reducir la abundancia de virus para impedir nueva infección. Entonces, los virus producidos son de células ya infectadas. Para cada experimento de producción vírica (Tabla 1) aproximadamente 500mL de muestra de agua, prefiltrada por 115µm, fueron fraccionados mediante un sistema de flujo tangencial equipado con cartuchos de 0.2µm y de 30 kDalton para obtener un concentrado de procariotas y agua libre de virus, respectivamente. Los procariotas fueron incubados en agua libre de virus en tubos de 50mL por triplicado durante 9 horas a la temperatura in situ y en oscuridad. Para evaluar la infección lisogénica se añadió mitomicina C (SigmaChemical Co, No. M-0503, concentración final de 1 µg mL?1) a 3 tubos adicionales con las incubaciones de procariotas en agua libre de virus para inducir el ciclo lítico en procariotas lisogénicos (Paul & Weinbauer, 2010). Las muestras sin tratamiento servían como control. Inmediatamente (t0) y cada 3 horas se tomaran muestras para las abundancias víricas y de procariotas que fueron fijadas con glutaraldehido (0.5% concentración final), incubadas 20-30 minutos a 4ºC, a continuación congeladas en nitrógeno liquido y almacenadas a ?20ºC para su posterior análisis con citometría de flujo. VPl se calculará VPl = (V2 ? V1) / (t2 ? t1) (1) donde V1 y V2 son las abundancias víricas y t1 y t2 el tiempo trascurrido. Dividiendo el numero de virus producidos por el numero de la progenie durante la lisis de una célula (Burst Size, BS) resulta en el numero de células infectadas. FIC = 100 x ([V2 ? V1] / BS / AP) (2) donde AP es la abundancia de procariotas a t0. La diferencia en la produccion vírica entre el tratamento de mitomicina C y el control es la VPi VPi = (VMC ? VC) / (t2 ? t1) (3) donde VMC y VC es la diferencia maxima en la abundancia vírica a los tiempos correspondientes en los tratamentos con mitomicina C y en los controles, respectivamente. Dividiendo el numero do virus inducidos por el BS y la abundancia de procriotas a t0 (AP) se estima FLC: FLC = 100 x ([VMC ? VC] / BS / BA) (4) Para obtener la tasa de lísis vírica, la producción vírica corregida por la abundancia de procariotas in situ se divide por el BS calculado según Wells & Deming (2006), es decir dividiendo el numero de virus producidos por el declive de la abundancia de procariotas durante las primeras horas de incubación. El carbono orgánico liberado durante la lísis vírica se calcula con el factor de 12.4 fg C celula-1 (Fukuda et al., 1998). La fracción de mortalidad de procariotas debido a la lísis vírica se estimará según el modelo de Binder (1999). VMM = FIC/LN(2) x (1 - 0.186 - FIC)) (5) Tasa de mortalidad por nanoflagelados y crecimiento de procariotas. Para cada experimento de depredación se hicieron incubaciones de 1L agua del mar, respectivamente, prefiltrado por 25µm para incluir solo femto-, pico- y nanoplancton y prefiltrado por 30kDalton (controles) por duplicado en botellas de policarbonato (Nalgene) a la temperatura in situ y en oscuridad durante 48 horas. Estas incubaciones serán utilizadas también para calcular la tasa de crecimiento de procariotas. Se tomaron muestras iniciales, finales y a los 12h para el recuento de procariotas y virus con citometría de flujo y para el recuento de nanoflagelados heterótrofos con microscopía de epifluorescencia (Porter & Feig, 1980). Para las preparaciones de microscopia se fijaron 20mL de muestra con glutaraldehido (previamente filtrado por 0.2µm) a una concentración final de 0.5% y se mantuvieron en oscuridad a 4ºC. Dentro de los 24 horas se filtraron las muestras sobre filtros negros de policarbonato de 0.8µm de poro, previa tinción con 4´,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). De estas preparaciones también se determinará el biovolumen de los nanoflagelados y se calculará la tasa potencial de depredación de procariotas por nanoflagelados basado en 105 procariotas biovolumen de nanoflagelados-1 h-1 (Fenchel, 1982). La tasa de crecimiento (µ, h-1) y la tasa de depredación (g, h-1) se estimarán mediante la diferencia de la concentración de procariotas en las incubaciones libre de depredadores y con la presencia de nanoflagelados, respectivamente (Frost, 1972). µ = (ln[nt/n0])/t (6) g = µ - (ln[Nt/N0])/t (7) donde nt y n0 son las abundancias de procariotas en los controles (filtrados por 30kDalton) y Nt y N0 son las abundancias de procariotas en las incubaciones filtrados por 25µm, a tiempo final y inicial, respectivamente. La mortalidad debido a protistas se determinara como porcentaje de la biomasa de los procariotas in situ. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Brussaard, C. P. D. (2004) Optimization of Procedures for Counting Viruses by Flow Cytometry. Appl. Environ. Microbiol., 70, 1506-1513. Christaki, U., Courties, C., Massana, R., Catala, P., Lebaron, P., Gasol, P., and Zubkov, M. V. (2011) Optimized routine flow cytometric enumeration of heterotrophic flagellates using SYBR Green I, Limnol. Oceanogr. Methods, 9, 329?339. Fenchel, T. (1982) Ecology of Heterotrophic Microflagellates. II. Bioenergetics and Growth. Marine Ecology Progress Series, 8, 225-231. Frost, B. W. (1972) Effects of size and concentration of food particles on the feeding behavior of the marine planktonic copepod Calanus pacificus. Limnology and Oceanography, 17, 805-815. Gasol, M. J. and Del Giorgio, P. A. (2000) Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina, 64, 197-224. Marie, D., Partensky, F., Vaulot, D. and Brussaard, C. (2001) Enumeration of phytoplankton, bacteria, and viruses in marine samples. Curr Protoc Cytom, Chapter 11. Paul, J. H. and Weinbauer, M. G. (2010) Detection of lysogeny in marine environments. In: C. Suttle, S. W. Wilhelm and M. G. Weinbauer (eds) Manual of Aquatic Viral Ecology. ASLO, pp. 1-8. Porter, K. G. and Feig, T. S. (1980) The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography, 25, 943-948. Weinbauer, M. G., Rowe, J. M. and Wilhelm, S. W. (2010) Determining rates of virus production in aquatic systems by the virus reduction approach. In: C. Suttle, S. W. Wilhelm and M. G. Weinbauer (eds) Manual of Aquatic Viral Ecology. ASLO, pp. 1-8. Wells, L. E. and Deming, J. W. (2006) Significance of bacterivory and viral lysis in bottom waters of Franklin Bay, Canadian Arctic, during winter. Aquatic Microbial Ecology, 43, 209-221.