Las leishmaniasis son un conjunto de enfermedades parasitarias causadas por diferentes especies del género Leishmania, pertenecientes al orden Kinetoplastida y a la familia Trypanosomatidae que se transmiten mediante la picadura de flebótomos (insectos, conocidos popularmente como “jejenes”) infectados. Constituyen un importante problema de salud pública a nivel mundial y se encuentran entre las enfermedades tropicales desatendidas más prevalentes, con más de mil millones de personas en riesgo de infección en más de 98 países endémicos, incluyendo a la Argentina. Anualmente se notifican entre 700 mil y 1 millón de casos nuevos en todo el mundo.

A diferencia de los métodos convencionales para detectar esa patología infecciosa, como la microscopía, especialistas del CONICET en el Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica (IMTIB, CONICET – Hospital Italiano de Buenos Aires – Universidad del Hospital Italiano de Buenos Aires) y de otras instituciones proponen una estrategia molecular que no solo mejora la capacidad para detectar la infección, sino que también permite conocer qué especie de Leishmania está involucrada. Los resultados del estudio fueron publicados en la revista científica Microbiology Spectrum.

“Un aspecto de nuestro avance es relevante porque las distintas especies de Leishmania pueden asociarse con diferentes manifestaciones clínicas y esta información puede contribuir a orientar el seguimiento y el abordaje terapéutico”, afirma Paula Ruybal, líder del trabajo e investigadora del CONICET en el Laboratorio de Investigación Biomolecular en Enfermedades Infecciosas (LIBEI) en el IMTIB.

La leishmaniasis cutánea (LC) es la forma clínica más frecuente y se presenta típicamente como lesiones cutáneas únicas o múltiples, comenzando como máculas que evolucionan a pápulas y finalmente a úlceras, con bordes regulares y elevados. La leishmaniasis mucocutánea (LMC) afecta la membrana mucosa de las vías respiratorias superiores y/o digestivas, y suele aparecer meses o años después de la LC. Por último, la leishmaniasis visceral (LV), la forma más grave, afecta los órganos hematopoyéticos y se caracteriza por fiebre, esplenomegalia (aumento del tamaño del bazo más allá de lo normal) y hepatomegalia (aumento del tamaño del hígado por encima de sus valores normales). Puede ser potencialmente mortal si no se diagnostica y trata oportunamente. Se estima que causa entre 20 mil y 30 mil muertes cada año a nivel mundial.

Diagnóstico molecular

El nuevo enfoque diagnóstico, que proponen los investigadores, se basa en dos técnicas de PCR (estrategia que permite amplificar un fragmento pequeño de ADN millones o miles de millones de veces en pocas horas) para la detección de la enfermedad y la caracterización del parásito que la causa.

“La primera es una PCR altamente sensible que permite detectar la presencia del ADN de Leishmania incluso cuando la cantidad de parásitos en la muestra es muy baja. Y con la segunda técnica de PCR, en las muestras positivas, amplificamos y secuenciamos un fragmento del gen hsp70, lo que permite identificar la especie responsable de la infección”, destaca Marikena Risso, primera autora del trabajo e investigadora del CONICET en el LIBEI.

El protocolo incorpora reactivos de fabricación nacional y su desarrollo y evaluación se realizó en colaboración con profesionales referentes en el diagnóstico de leishmaniasis del Hospital de Infecciosas “Francisco Javier Muñiz” y del Hospital de Clínicas “José de San Martín” (UBA), que participaron activamente del trabajo. Durante su desarrollo, el protocolo se aplicó a muestras clínicas de pacientes con sospecha de leishmaniasis y se compararon los resultados con los obtenidos mediante microscopía.

“El algoritmo fue puesto a prueba con éxito en dos de los centros participantes, demostrando su robustez. Finalmente, secuenciamos el gen hsp70 de las muestras positivas y analizamos las secuencias para confirmar la identificación de las especies de Leishmania. Esto nos permitió observar que la estrategia propuesta es sensible, reproducible y confiable para el diagnóstico y la identificación de especies de este parásito”, explica Risso.  Y agrega: “El estudio permitió integrar las capacidades del laboratorio de investigación con la experiencia diagnóstica y clínica de instituciones que reciben pacientes con sospecha de leishmaniasis”.

A diferencia de los métodos convencionales, como la microscopía, afirma la investigadora, la estrategia propuesta “no solo mejora la capacidad para detectar la infección, sino que también permite conocer qué especie de Leishmania está involucrada. Este es un aspecto relevante porque las distintas especies pueden asociarse con diferentes manifestaciones clínicas y esta información puede contribuir a orientar el seguimiento y el abordaje terapéutico”.

Y continúa: “De esta manera, proponemos avanzar desde un diagnóstico basado únicamente en confirmar la presencia del parásito hacia una estrategia más completa que incorpore la identificación de la especie como parte del algoritmo diagnóstico. Esta información aporta valor tanto para el manejo clínico de los pacientes como para la vigilancia epidemiológica, ya que permite conocer mejor qué especies de Leishmania circulan en nuestro país y contribuir a fortalecer las estrategias de diagnóstico y control de la enfermedad”.

Para el grupo de trabajo ninguna herramienta diagnóstica, por sí sola, puede responder todas las preguntas que plantea un paciente con sospecha de leishmaniasis. “La evaluación clínica, las pruebas serológicas y las técnicas moleculares aportan información diferente y complementaria al diagnóstico por microscopía, que a pesar de sus limitaciones sigue siendo la técnica de referencia. Integrarlas permite llegar a diagnósticos más precisos, orientar mejor el manejo de cada paciente y, mediante la tipificación molecular, conocer la especie de Leishmania involucrada”, afirma Ruybal.

La propuesta diagnóstica de muy alta sensibilidad, como la desarrollada por los investigadores del IMTIB, reduce el subdiagnóstico al detectar la infección aun cuando hay pocos parásitos en la muestra, facilitando el acceso oportuno al tratamiento.

“A la luz de los resultados de nuestro trabajo, consideramos que la implementación de este abordaje integrado permitiría avanzar hacia una estrategia superadora respecto de aquellas que se aplican actualmente de manera general en el ámbito clínico, al complementar la información clínica y serológica con herramientas moleculares capaces no sólo de detectar el parásito, sino también de identificar la especie involucrada”, concluye Ruybal.

El siguiente paso es ampliar la aplicación de esta estrategia molecular a un mayor número de muestras provenientes de distintas regiones del país, con el objetivo de profundizar el conocimiento sobre la diversidad genética y la distribución de las especies de Leishmania que circulan en Argentina. “Para ello, venimos trabajando en conjunto con la Sección de Parasitología del Hospital de Infecciosas ‘Francisco Javier Muñiz’ y con la División de Infectología del Hospital de Clínicas ‘José de San Martín (UBA)’”.

Si bien la estrategia molecular desarrollada mostró un muy buen desempeño en el estudio, antes de que pueda incorporarse de manera más amplia a la práctica diagnóstica “es necesario completar las etapas de validación correspondientes”, afirma Ruybal.  Y continúa: “En este sentido, nos encontramos articulando con autoridades sanitarias nacionales y laboratorios de referencia la puesta en marcha de un proceso de validación interlaboratorio que permita evaluar su desempeño en diferentes ámbitos y generar la evidencia necesaria para favorecer su futura incorporación al sistema de salud”.

Como parte de esta línea de trabajo, recientemente los autores del estudio obtuvieron un “Proyecto de Investigación en Temas Estratégicos Territoriales en Red (PIET-R)”, financiado por CONICET, que reúne investigadores del Instituto de Patología Experimental (IPE, CONICET-UNSa), el IMTIB, la Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la UNL, el Instituto de Investigaciones para la Industria Química (INIQUI, CONICET-UNSa), la Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA, CONICET-UNC) y el Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIBIO, UNSaM-CONICET).

“El objetivo de esta red es optimizar el abordaje integral de las leishmaniasis en Argentina mediante el desarrollo de herramientas diagnósticas accesibles, la caracterización genética del parásito y el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas”, concluye Ruybal.

Del trabajo también participaron Wendy Lorena Quintero-Garcia (también primera autora del estudio), Juan José Lauthier, Giuliana Saggion y Carlos Parra, del LIBEI; Catalina Gauder, German Astudillo, Sofía Echazarreta, del Hospital de Infecciosas “Francisco Javier Muñiz”; Mónica Beatriz Foccoli  y Ana Andrea Pisarevsky, del Hospital de Clínicas “José de San Martín” (UBA); y  Silvia Analia Repetto, del Hospital de Clínicas “José de San Martín” (UBA) y del Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPaM, CONICET-UBA).