IBR   13079
INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Desarrollo de Controles Internos Competitivos Estables para la Detección Precoz de Cepas del VIH-1 Circulantes en Argentina.
Autor/es:
PEREZ, G. R.; TABORDA, MIGUEL A.; GARDIOL, DANIELA; GIRI ADRIANA A
Lugar:
Huerta Grande, Córdoba
Reunión:
Congreso; XXIX Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Virología Asociación Argentina de Microbiología; 2009
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Virología (SAV)
Resumen:
El diagnóstico molecular basado en RT-PCR para la detección de virus con genoma a ARN se ve a menudo condicionado por la falta de controles internos (CI) lo cual puede conducir a resultados falsos negativos. En este trabajo se describe una estrategia para la producción de CI competitivos (CIC) y estables para la detección molecular del ARN de los distintos subtipos e inter-subtipos del HIV-1 circulantes en Argentina. En primer lugar, se realizó un apilamiento de 1.745 secuencias nucleotídicas de la región gag para diseñar cebadores que permitan amplificar un amplio espectro de subtipos e inter-subtipos del HIV-1. En base a este análisis, se diseñaron cebadores genéricos Gagp24 y una sonda para evaluar la especificidad de los amplicones resultantes. La funcionalidad de los oligonucleótidos diseñados se evaluó con un ensayo que combina PCR, hibridación líquida de los amplicones con sondas no radioactivas y detección por enzimoinmunoanálisis, utilizándose genomas de los subtipos F, B y B/F como controles positivos. El límite de detección fue de 50 copias/reacción para todos los subtipos. Posteriormente se procedió a la construcción del CIC el cual es un derivado del fago Qß (rQß) en el cual fueron insertados los cebadores específicos para la detección del ARN del HIV-1. Qß es un colifago con genoma a ARN simple hebra del cual se dispone su genoma clonado como ADNc en un vector de expresión bajo el control del promotor T7 (pBRT7Qß). Se diseñaron cebadores de 50 pb que contenían i) sitios de restricción de las enzimas Bst98I o NsiI, necesarios para el clonado; ii) las secuencias de los cebadores Gagp24, y iii) secuencias fágicas de la región A1 para permitir la hibridación al genoma fágico salvaje. Estos oligonucleótidos se utilizaron para producir un fragmento quimera por PCR a baja astringencia utilizando pBRT7Qß como molde. Los amplicones obtenidos fueron digeridos con Bst98I y NsiI, y clonados en pBRT7Qß previamente cortado con el mismo par de enzimas de restricción que presentan un sitio de reconocimiento único en Qß. De esta manera se obtuvo el ADNc del genoma del fago modificado bajo el control transcripcional del promotor T7 (pBRT7Qßr). El pBRT7Qßr fue utilizado para transformar bacterias E. coli BL21 pLys S/DE3, se largaron cultivos, se indujeron con IPTG y a partir de éstos se obtuvieron las partículas fágicas de Qßr. Experimentos para evaluar la estabilidad y funcionalidad del CIC para VIH-1 están en curso. Hemos desarrollado un ARN recombinante empaquetado en cápsides, que hibrida con los mismos cebadores que el virus diana presentando eficiencia de amplificación similar que el ácido nucleico target. Su aplicación como CIC lo convierte en un reactivo fundamental para el diagnóstico temprano del VIH-1, para el tamizaje molecular en bancos de sangre y para la generación de estandares de reacciones de amplificación en tiempo real. La estrategia aquí presentada es versátil, de bajo costo y puede ser adaptada para la detección cualitativa o cuantitativa de otros virus con genoma a ARN. Financiamiento: FIC (D43 TW001037)