IBR   13079
INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Desarrollo de un control interno para la detección precoz de cepas del VIH-1 circulantes en Argentina
Autor/es:
PEREZ, G. R.; TABORDA, MIGUEL A.; GARDIOL, DANIELA; GIRI ADRIANA A
Lugar:
Salta
Reunión:
Congreso; II Congreso Nacional de SIDA; 2009
Institución organizadora:
Sociedad Argentina Interdisciplinaria de SIDA (SAISIDA)
Resumen:
El diagnóstico molecular basado en RT-PCR para la detección de virus con genoma a ARN se ve condicionado por la falta de controles internos (CI) que permitan verificar todas las etapas analíticas y cumplan con los requisitos para el diagnóstico: características similares al virus target, inocuos y estables. En este trabajo se describe una estrategia para el desarrollo de un ensayo con CI competitivo (CIC) y específico para la detección molecular del ARN de los distintos subtipos e inter-subtipos del VIH-1. En primer lugar, se realizó un apilamiento de 1.745 secuencias nucleotídicas de la región gag para diseñar cebadores que permitan amplificar un amplio espectro de subtipos e inter-subtipos del VIH-1. En base a este análisis, se diseñaron cebadores genéricos Gagp24 y una sonda para evaluar la especificidad de los amplicones resultantes. La funcionalidad de los oligonucleótidos diseñados se evaluó con un ensayo que combina PCR, hibridación líquida de los amplicones con sondas no radioactivas y detección por enzimoinmunoanálisis, utilizándose genomas de los subtipos F, B y B/F como controles positivos. El límite de detección fue de 50 copias/reacción para todos los subtipos. Posteriormente se procedió a la construcción del CIC. Para ello se utilizó el colifago Qß del cual se dispone su genoma clonado como ADNc en un vector de expresión bajo el control del promotor T7 (pBRT7Qß). Se reemplazaron secuencias fágicas de la región A1 del genoma de Qß por los cebadores Gagp24, siguiendo un procedimiento similar al previamente utilizado para la construcción de un CIC específico para el diagnóstico del virus de hepatitis C. De esta manera se obtuvo el ADNc del genoma de Qß modificado bajo el control transcripcional del promotor T7 (pBRT7Qßr). El pBRT7Qßr fue utilizado para transformar bacterias E. coli BL21 pLys S/DE3, y se indujo la producción de partículas fágicas Qßr con IPTG. Experimentos para evaluar la estabilidad y funcionalidad del CIC para VIH-1 están en curso. Conclusiones Hemos desarrollado un ARN recombinante empaquetado en cápsides, que hibrida con los mismos cebadores que el virus diana presentando eficiencia de amplificación similar que el ácido nucleico target. Su aplicación como CIC lo convierte en un reactivo fundamental para el diagnóstico temprano del VIH-1, para el tamizaje molecular en bancos de sangre y para la generación de estandares de reacciones de amplificación en tiempo real. Financiamiento: FIC (D43 TW001037)