Contribución de factores celulares y virales en la progresión de neoplasias asociadas a infecciones con Papilomavirus humanos.

FACCIUTO F., BUGNON VALDANO M, CAVATORTA AL, GARDIOL D.

Huerta Grande, Córdoba

Congreso; XXIX Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Virologia; 2009

Sociedad Argentina de Virología

Contribución de factores celulares y virales en la progresión de neoplasias asociadas a infecciones por Papilomavirus humanos. Las proteínas E6 derivadas de Papilomavirus humanos (HPV) oncogénicos tienen la habilidad de interferir con la función de un grupo de proteínas involucradas en el control de la polaridad y adhesión celular. Dichas proteínas contienen dominios proteicos característicos denominados PDZ. Entre ellas se encuentra la proteína Disc large (DLG1) ubicada en las uniones de tipo adherentes. La interacción de DLG1 con E6 de HPV ha sido investigada, y hemos demostrado que los niveles de dicha proteína disminuyen durante la progresión maligna asociada a HPV. Sin embargo, los mecanismos que regulan la expresión génica de DLG1 no han sido completamente caracterizados. En este sentido, hemos reportado previamente el análisis funcional de su región promotora y la regulación negativa de su expresión por parte de factores de la familia Snail. A posteriori, y mediante el uso de técnicas de amplificación rápida de los extremos del cADN identificamos un evento de splicing alternativo en la región 5’ no traducible (5’UTR) del ARNm de DLG1, de esta manera se generan transcriptos con dos 5’UTR diferentes. Mediante ensayos de RT-PCR pudimos demostrar que ambas formas de 5’UTR de DLG1 se expresan diferencialmente en distintas líneas celulares. A través de análisis de real time RT-PCR y tratamiento de las células con Actinomicina, observamos que el transcripto corto presenta una mayor estabilidad. Mediante experimentos de luciferasa demostramos que la secuencia 5’ UTR de DLG1 que contiene el exon alternativo, disminuye la eficiencia de traducción de un ORF clonado corriente abajo de las distintas 5’UTR de DLG1. El conjunto de datos obtenidos sugiere que el evento de splicing alternativo identificado podría contribuir con la regulación de la expresión de DLG1. Por otro lado, iniciamos estudios para analizar la habilidad de E6 de HPV de interferir con las uniones de tipo tight y con la polaridad celular. Esto último considerando que la polaridad celular depende de tales uniones y de la correcta localización de los lípidos fosfatidilinositol fosfatos (PIP) que interaccionan con proteínas PDZ presentes en dichas uniones tight. Para ello, clonamos la proteína E6 derivadas de distintos HPV como proteínas de fusión al epitope de hemaglutinina del virus influenza (HA), se generaron líneas celulares epiteliales estables expresando tales proteínas, y se corroboró la expresión y localización de las proteínas E6 por inmunofluorescencia (IF). Las diferencias en la distribución de PIP en presencia o ausencia de las diferentes proteínas E6 está siendo evaluada a través un biosensor, el dominio PH de la fosfolipasa C fusionado a la proteína verde fluorescente, que permite analizar por fluorescencia la localización de PIP en las membranas, como un índice de la polaridad celular. Este estudio ha permitido avanzar sobre el conocimiento de los mecanismos que regulan la expresión de una proteína de adhesión celular, el oncosupresor DLG1, de manera de poder explicar su expresión diferencial durante la evolución neoplásica asociada a HPV. Además constituye una de las primeras investigaciones acerca de la interferencia de HPV con la polaridad celular, característica clave en la progresión maligna.