IBR   13079
INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Estrategia para la producción de controles internos competitivos estables para la detección de virus con genoma a ARN mediante RT-PCR.
Autor/es:
PEREZ, G. R.; GOMEZ CARRILLO, MANUEL; TABORDA, MIGUEL A.; GIRI ADRIANA ANGELICA
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Microbiología
Resumen:
El diagnóstico molecular basado en RT-PCR para la detección de virus con genoma a ARN se ve a menudo condicionado por la falta de controles internos estables lo cual puede conducir a resultados falsos negativos. En este trabajo se describe una estrategia para la producción de controles internos competitivos (CIC) estables. El CIC es un derivado del fago Qß (rQß) en el cual fueron insertados los cebadores específicos para la detección del ARN del Virus de la Hepatitis C (VHC) o del Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1). Qß es un colifago con genoma a ARN simple hebra del cual se dispone su genoma clonado como ADNc en un vector de expresión bajo el control del promotor T7 (pBRT7Qß). Se diseñaron cebadores de 50 pb que contenían i) sitios de restricción de las enzimas Bst98I o NsiI, necesarios para el clonado; ii) las secuencias de los cebadores específicos para VHC o VIH-1, y iii) secuencias fágicas de la región A1 de Qß para permitir la hibridación al genoma fágico salvaje. Estos oligonucleótidos se utilizaron para producir un fragmento quimera por PCR a baja astringencia utilizando pBRT7Qß como molde. Los amplicones obtenidos fueron digeridos con Bst98I y NsiI, y clonados en pBRT7Qß previamente cortado con el mismo par de enzimas de restricción que presentan un sitio de reconocimiento único en Qß. De esta manera se obtuvo el ADNc del genoma del fago modificado bajo el control transcripcional del promotor T7 (pBRT7Qßr). El pBRT7Qßr fue utilizado para transformar bacterias E. coli BL21 pLys S/DE3, se largaron cultivos, se indujeron con IPTG y a partir de éstos se obtuvieron las partículas fágicas de Qßr. El fago recombinante obtenido se ensayó en experimentos de infección de E. coli, los cuales demostraron su funcionalidad y viabilidad.Según nuestra estrategia, el CIC es añadido a la muestra de plasma y procesado conjuntamente con el ARN del virus blanco. Los ARNs son retrotranscriptos utilizando cebadores antisentido conjugados a biotina en su extremo 5’ y amplificados en una única reacción con el agregado de los cebadores sentido. Posteriormente, los amplicones resultantes de la reacción de RT-PCR son sometidos a hibridación líquida y diferenciados con sondas específicas para cada target (CIC y virus blanco), las cuales han sido sintetizadas con la inclusión de una molécula de fluoresceína en el extremo 5’. Finalmente, los híbridos son capturados en una microplaca revestida con estreptavidina a través de la unión con la biotina presente en el extremo 5’ de los amplicones y detectados con un anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa de rábano y un cromóforo.El ensayo de RT-PCR con CIC para VHC posee una sensibilidad analítica de 500 UI/ml de ARN de VHC y puede detectar todos los genotipos de VHC presentes en Argentina. El Qßr para VHC fue estable por al menos 452 días a 4ºC y por 125 días luego de su reconstitución a partir del liofilizado. No hubo influencia del CIC en la detección cualitativa de VHC independientemente de la carga viral de las muestras. Los experimentos para evaluar la estabilidad y funcionalidad del CIC para VIH-1 están en curso.