LOS CUÁDRUPLEX DE G CONTROLAN IN VIVO LA EXPRESIÓN DE GENES REGULADOS EN EL DESARROLLO

PABLO ARMAS; NORA B CALCATERRA; ALDANA DAVID

Chascomús

Taller; 3° Taller de Biología Celular y del Desarrollo; 2016

El desarrollo embrionario depende de la regulación precisa de la expresión génica mediante el control transcripcional mediado tanto por proteínas como por el estado de la cromatina. Los cuádruplex de G (G4) son estructuras no canónicas formadas transitoriamente en el ADN genómico que modulan el estado de la cromatina afectando la integridad del genoma y la expresión génica.Aunque la formación y función de los G4 se evidenció in vitro e in cellulo, la relevancia de estas estructuras in vivo no fue demostrada. Nuestro objetivo fue evaluar la función in vivo de G4 conservados en el control transcripcional de genes necesarios para el desarrollo embrionario, utilizando el modelo de pez cebra. Estudios previos in silico permitieron encontrar 13 genes con funciones en el desarrollo que presentan secuencias con potencial para formar G4 (PQS) en sus regiones promotoras (-1000 pb) conservadas entre pez cebra, ratón y humanos. Para siete de esos genes se confirmó in vitro la formación de G4, y se seleccionaron tres para estudios adicionales: col2a1a, fzd5 y nog3. En este trabajo presentamos un análisis in cellulo del papel de esos G4 en latranscripción mediante la transfección de la línea celular Neuro2A con construcciones de las PQS humanas y de pez cebra controlando la transcripción del gen reportero luciferasa. Los resultados mostraron que todos G4 analizados tienen un papel potenciador de la transcripción. La función in vivo de estos G4 se analizó mediante alteración específica de su formación por microinyección de embriones de pez cebra con oligonucleótidos antisentido (ASO). Esta estrategia condujo a la reducción de la transcripción de los tres genes analizados, lo que fue determinado por RT-qPCR y observado mediante hibridación in situ. Además, la intervención de los G4 por los ASO provocó cambios morfológicos similares a los reportados para la pérdida de función de estos genes. Para el caso de nog3, el fenotipo craneofacial obtenido fue rescatado con la co-inyección del ARNm denog3. Estos resultados indican que los G4 funcionan como moduladores de la transcripción in vivo y actúan como elementos conservados de sintonía fina de la expresión génica durante el desarrollo.