IBR   13079
INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
METODOLOGÍAS PARA LA PRESERVACIÓN DE CÉLULAS MADRE NEURONALES EMBRIONARIAS (CMNE) DE ORIGEN MURINO. ESTUDIO DE LA DIFUSIÓN DEL AGENTE CRIOPROTECTOR (ACP) DIMETILSULFÓXIDO (DMSO)
Autor/es:
MARÍA C. ROBERT; JOAQUIN VALENTIN RODRIGUEZ; MENDIA A; BANCHIO C; MONTANER A
Lugar:
Rosario
Reunión:
Jornada; x Jornadas de Ciencia y Tecnología; 2016
Institución organizadora:
Universidad Nacional de Rosario
Resumen:
El desarrollo de protocolos de criopreservación de células requiere del estudio de las condiciones experimentales en las que se producirá el agregado del ACP a la suspensión celular, esto involucra un compromiso entre la concentración del ACP, la temperatura y tiempo de incubación, a los fines de no afectar la viabilidad y función del preparado post-preservación a -196C. El objetivo principal del trabajo fue determinar las condiciones experimentales óptimas que garanticen la difusión del DMSO (ACP) a las CMNE. Las CMNE obtenidas de cerebros de embriones de ratones (13-15 días), fueron cultivadas como neuroesferas, luego disgregadas y resuspendidas como células individuales en medio DMEM/F12/B27 + Suero fetal bovino 10 %, [cel]=1*106cel/mL. Para la determinación cuantitativa de la [DMSO] intra y extracelular se utilizó la técnica de HPLC descripta por Carpenter JF et al. Cryobiology 28:210-215 (1991). Para estimar el volumen celular se determinó el contenido de H2O intracelular y su corrección para el fluido adherente mediante la distribución de 3H2O (Ci/mL) e 14C-Inulina (Ci/mL). Se agrego DMSO 10% a la suspensión celular y a una fracción se adicionaron además las sustancias radiactivas. Después de 2.5, 10 y 20 min de incubación a la temperatura seleccionada se tomo 1 mL de la suspensión celular en cada caso y se centrifugó. El paquete celular y el sobrenadante fueron separados. En las muestras sin radiactivo se determinó la [DMSO] en el pellet y en el medio de incubación, y en las muestras con radiactivo el paquete celular fue disuelto en fluido de centelleo. Tanto en el sobrenadante como en el paquete celular se determinó la radioactividad utilizando un Contador de Centelleo Líquido con el fin de estimar los espacios acuosos de las CMNE. Las temperaturas de incubación evaluadas fueron: 10, 20 y 30C, determinándose además la distribución de agua a 37C. Se determinó la relación [DMSO]cel/ [DMSO]medio, la evolución del H2Ointracel, la acumulación celular del DMSO en función del tiempo y de la temperatura de incubación. Además se estimó la viabilidad celular utilizando el test de exclusión de Azul Trypan. La relación [DMSO]cel/ [DMSO]medio(Rel), obtenida durante la incubación a 20 y 30 C durante 10 minutos mostró la siguiente relación: Rel20C: 0.62  0.05, n=3 y Rel30C: 0.72  0.101, n=3. Se obtuvo la mayor acumulación de DMSO para la incubación a 30 C: 436  22g DMSO/106cel (n=3). Las viabilidades celulares obtenidas fueron mayores al 94%. La difusión y acumulación del DMSO es directamente proporcional a la temperatura de incubación. Tanto a 20°C como a 30°C el DMSO ingresa a las células en concentraciones adecuadas a un tiempo de incubación de 10 min obteniéndose una relación [DMSO]cel/ [DMSO]medio aproximada a 1, siendo necesario un tiempo de incubación no mayor a 10 minutos. La difusión del DMSO no aumenta de manera significativa al incrementar el tiempo de exposición.