IBR   13079
INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
DESARROLLO DE UNA CÁMARA DE HIPOXIA PARA ESTUDIOS IN VITRO DE ISQUEMIA CEREBRAL EN CULTIVOS NEURONALES.
Autor/es:
RODRIGUEZ J.V.; M. CELESTE ROBERT; JUAN DE PAZ L.
Lugar:
Rosario
Reunión:
Jornada; x Jornadas de Ciencia y Tecnología; 2016
Institución organizadora:
Universidad Nacional de Rosario
Resumen:
El daño cerebral por isquemia/reperfusiòn es de gran interés clínico, ya que se encuentra asociados con varias condiciones patofisiológicas. Sin embargo, los mecanismos de daño por hipoxia no están completamente dilucidados. El estudio in vitro, mediante cultivos neuronales es una gran herramienta para la investigación de los efectos celulares y moleculares asociados a los procesos isquémicos. Diferentes modelos in vitro (cámaras de hipoxia, incubadoras tri-gases, generación química o enzimática de hipoxia) son utilizadas para imitar el escenario clínico y develar los mecanismos subyacentes. Sin embargo, todos estos modelos poseen diferentes desventajas que van desde su alto costo, provisión continua de N2, toxicidad del compuesto químico inductor, hasta incapacidad de cultivar distintas líneas celulares en distintas condiciones en la misma incubadora. Ante la necesidad de contar con una cámara de hipoxia, económica, confiable, y portable, decidimos desarrollar un modelo apropiado para ser utilizado en incubadoras estándares de laboratorio. Basándonos en la cámara de hipoxia de Wright y Shay (Nature Protocols, 2006, 1 (4):2088) desarrollamos una cámara alternativa con los materiales disponibles en el mercado local. Como cuerpo se utilizaron potes de PVC de Línea U de 1500 cc, con boca de diámetro ( 130 mm) con tapa. Cada cámara se construyó con un pote colocado de manera invertida (tapa sobre la mesada). En el cuerpo de la cámara (en la parte superior) y en uno de los laterales se realizaron perforaciones ( 13 mm) adónde se insertaron llaves de PVC de dos vías con válvula reguladora que permiten: a- el ingreso de la mezcla de gases deseada (95% N2/5% CO2) y b- purgar el contenido de gases de la cámara. La unión de la tapa con el pote fue recubierta con grasa de alto vacío, para evitar el intercambio de gases. Sobre la tapa inferior se coloca una placa de cultivo de 100 mm, conteniendo agua destilada estéril (para mantener la humedad dentro de la cámara) previamente saturada durante 15 min con 95% N2/5% CO2 a un flujo de 2 L/min. Sobre ésta, se colocan las placas de cultivos que contendrán las células (hasta 3 placas por cámara), a las cuales se les ha agregado el medio de cultivo a utilizar (Hank?s Balanced Salt Solution) previamente saturado con 95% N2/5% CO2 durante 10 min a un flujo de 2L/min. Una vez que todas las placas se encuentran dispuestas sobre la tapa del pote, se procede a cerrar, purgar y saturar la cámara con 95% N2/5% CO2 durante 10 min a un flujo de 2L/min para lograr la eliminación del O2 del interior de la misma (todo el procedimiento se realizó en esterilidad). Finalmente, las válvulas de entrada y salida de los gases fueron cerradas y la cámara de hipoxia fue colocada dentro de una incubadora (Sanyo MCO-17AC) a 37°C, 5% CO2/ Aire, en cada paso del protocolo y durante períodos de 2 a 24 horas se analizó la concentración de O2 en las soluciones mediante un electrodo de Clark acoplado a un oxígrafo (YSI 5300 Biological Oxygen Monitor - Yellow Springs, Ohio, USA). La cámara de hipoxia aquí presentada nos permitió alcanzar un nivel promedio de O2 de aproximadamente el 7,3 ± 1,7 % durante 24 horas de incubación.