BÚSQUEDA DE NUEVOS BLANCOS PARA ANTIBIÓTICOS EN Staphylococcus aureus. LIPOILACIÓN DE PROTEÍNAS.

DE MENDOZA, D; MANSILLA, MC; RASETTO, N

Rosario

Jornada; X Jornada de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Rosario; 2016

El ácido lipoico (AL) es uncofactor organosulfurado presente en todos los dominios de la vida. Forma partede complejos enzimáticos involucrados en el metabolismo oxidativo y de uncarbono y es también un potente antioxidante. Gran parte de la informacióndisponible acerca del metabolismo de AL proviene de estudios realizados en labacteria Gram-negativa Escherichia coli.Ésta posee dos vías redundantes de lipoilación: puede sintetizar AL a partir deun intermediario de la síntesis de ácidos grasos o utilizar el lipoato presenteen el medio de cultivo. La biosíntesis del cofactor ocurre por un mecanismo dedos reacciones. La primera implica la transferencia de la porción octanoilodesde octanoil-ACP a los dominios lipoilables de los complejos enzimáticos,catalizada por la enzima LipB, una octanoil-[ACP]: proteína N-octanoiltransferasa. La segundainvolucra la adición de dos átomos de azufre a la cadena hidrocarbonada del octanoilo unido a la enzima,y es catalizada por LipA, una lipoato sintasa. Además el AL puede ser tomadodirectamente del medio y ligado a los dominios lipoilables en una reaccióncatalizada por LplA, una lipoato ligasa. Recientemente en nuestro laboratoriose han dilucidado los mecanismos de lipoilación en la bacteria modeloGram-positiva Bacillus subtilis. Adiferencia del modelo de dos proteínas de E.coli, en B. subtilis serequerirían al menos cuatro proteínas para la lipoilación endógena: LipM(octanoil-[ACP]: proteína N-transferasa),GcvH (subunidad H del sistema de clivaje de glicina), LipL (GcvH:[dominiolipoilable] amidotransferasa), y LipA. Por otro lado, el lipoato provenientedel medio es transferido a los dominios lipoilables en una reacción de dospasos dependiente de ATP, catalizada por LplJ, la lipoato ligasa de B. subtilis. LipL estaría tambiéninvolucrada en esta vía, con un rol aún no determinado.En este trabajo usamos mutantesde B. subtilis en distintos pasos de lasvías de síntesis y ligación de AL para determinar la participación de LipL enla lipoilación exógena. Realizando ensayos de Western blot pudimos determinarque esta proteína es esencial para la ligación de lipoato a la subunidad E2 dela deshidrogenasa de cetoácidos ramificados. Esta observación coincide con los severosdefectos de crecimiento de las mutantes lipL,aún con el suplemento de AL en el medio de cultivo. LipL también es necesariapara la ligación de octanoato a las apoproteínas. Para determinar si serequiere la actividad de LipL para la óptima ligación de lipoato, o sólo serequiere una interacción proteína-proteína que estabilice a LplJ, se expresaronproteínas mutantes en el sitio activo de LipL y se llevaron a cabo experimentosde crecimiento en medios definidos y ensayos de Western blot. Se pudodeterminar que para que LplJ ligue AL eficientemente hace falta que LipLsea funcional. Mediante ensayos de doble híbrido se determinó que no hayinteracción entre las proteínas antes mencionadas, sugiriendo que estas podríanactuar de modo secuencial durante la ligación de AL. Cabe destacar que laproteína LipL, que juega un rol fundamental tanto en la vía de síntesis como deutilización de AL, está ausente en mamíferos pero conservada enespecies Gram positivas patógenas para los humanos, locual la convierte en un excelente blanco para el desarrollo de nuevoscompuestos antimicrobianos.