CONSTRUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA CEPA SOBREEXPRESANTE DE LA PROTEÍNA HIGH MOBILITY GROUP B DE TRYPANOSOMA CRUZI

TAVERNELLI, LUIS; PERDOMO, VIRGINIA; MERLI, MARCELO; CRIBB, PAMELA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2015

Sociedad Argentina de Protozoología

Las High Mobility Group B son una familia de proteínas de la cromatina que participan en diversas funciones como la transcripción, reparación y replicación del ADN. La HMGB de Trypanosoma cruzi (TcHMGB) presenta dos dominios de unión al ADN ?HMG-box? y un dominio N-terminal único de las HMGBs de tripanosomas. Nuestro objetivo general es dilucidar el rol de TcHMGB en el control de la expresión génica. La secuencia codificante de TcHMGB se clonó en el vector pTcINDEX-GW, con dos epítopes de hemaglutinina (HA) en tándem que nos permiten usar anticuerpos comerciales para ensayos de inmunolocalización e inmunoprecipitación. Se transfectaron epimastigotes de la cepa de T. cruzi Dm28c/pLEW13 con el vector pTcINDEX-TcHMGB(HA)2. La sobreexpresión de la proteína en los transfectantes, se verificó mediante Western Blot utilizando anticuerpos anti-TcHMGB y anti-HA. Por otro lado se cuantificaron los niveles de transcripto mediante PCR en tiempo real, usando GAPDH como gen de referencia. La localización subcelular de la proteína en el parásito se verificó mediante inmunoflorescencia utilizando anticuerpos anti-HMGB y anti-HA, confirmándose la localización nuclear de la TcHMGB exógena. Como primera aproximación para determinar el efecto de la sobreexpresión de TcHMGB en el parásito, se realizaron curvas de crecimiento donde se observó una disminución del crecimiento a partir del sexto día, usando la cepa que porta el vector vacío como control. Se evaluó además el efecto de la sobreexpresión de TcHMGB sobre la metaciclogénesis in vitro. Por último, se midió el porcentaje de infectividad de la cepa sobreexpresante con respecto a aquella que porta el plásmido vacío sobre células Vero. Actualmente se están construyendo cepas sobreexpresantes de versiones truncadas de TcHMGB, que podrían funcionar como mutantes dominante negativas, contribuyendo a la comprensión de las funciones de TcHMGB y de sus distintos dominios en el parásito T cruzi.