Análisis de la regulación de la expresión de la expresión del oncosupresor Disc large, un blanco de la proteína E6 de HPV oncogénicos.

CAVATORTA, AL; GIRI, AA; BANKS, L; GARDIOL D

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología.; 2008

Sociedad Argentina de Virología

Las proteínas E6 derivadas de papilomavirus humanos (HPV) de alto riesgo se unen al oncosupresor Disc Large (Dlg) y estimulan su degradación por el mecanismo proteolítico dependiente de ubiquitina. Dlg es una proteína que participa en la formación de las uniones intercelulares, en el control de la polaridad y proliferación celular y en el mantenimiento de la arquitectura de los tejidos. En trabajos anteriores demostramos que la expresión de Dlg se encuentra notablemente desminuida en carcinomas cervicales asociados a HPV, así como en otros tumores como adenocarcinoma de colon. Estos y otras evidencias han sugerido un rol importante para Dlg en los mecanismos de supresión oncogénica. Sin embargo, los mecanismos que regulan la transcripción de Dlg son desconocidos hasta el momento así como los patrones transcripcionales en los distintos estadíos de la progresión maligna. Por ello nos propusimos analizar los mecanismos de regulación de Dlg. En primera instancia clonamos y estudiamos funcionalmente el promotor. Analizamos regiones genómicas 5’ “upstream” del sitio de iniciación de la trascripción reportado para Dlg y las mismas se clonaron en vectores reporteros. La actividad promotora fue determinada mediante ensayos de actividad “luciferasa” en distintas líneas celulares. Mediante deleciones en la zona 5’ del promotor pudimos determinar las secuencias mínimas requeridas para la actividad transcripcional, así como dominios en cis que activan o reprimen la transcripción. Análisis por bioinformática demostraron la presencia de sitios consenso de unión a factores transcripcionales de la familia Snail en las secuencias clonadas. Las proteínas Snail reprimen numerosos oncosupresores y su expresión está aumentada en tumores. Mediante experimentos de co-transfección y ensayos de luciferasa, demostramos que Snail reprime también el promotor de Dlg, y mutaciones en los sitios consenso de unión a estos reguladores disminuyen el efecto represor. Más aún, la sobre-expresión de Snail en células CaCo-2, conlleva a un reducción en los niveles de Dlg. Ensayos de inmuno-precipitación de la cromatina demostraron la interacción directa de las proteínas Snail con la región promotora de Dlg in vivo. En conclusión, pudimos clonar y analizar funcionalmente la región promotora de Dlg, un blanco importante de las oncoproteínas E6 de HPV. Observamos que los factores Snail, que reprimen diversos marcadores epiteliales, reprimen también la expresión de Dlg mediante la unión directa a regiones presentes en su promotor. Estos estudios son los primeros en analizar la actividad y regulación trancripcional del gen Dlg y contribuyen al entendimiento de las variaciones de sus niveles en las lesiones asociadas a HPV y en otros tumores.