IBR   13079
INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
DETERMINANTES ESTRUCTURALES DE LA SELECTIVIDAD DE METAL DE LA SUPERÓXIDO DISMUTASA DE Rhodobacter capsulatus.
Autor/es:
DI CAPUA, CECILIA BEATRIZ; TABARES, LEANDRO CESAR; CORTEZ, NESTOR RICARDO
Lugar:
Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Reunión:
Congreso; Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Microbiología General (SAMIGE); 2007
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Microbiología General (SAMIGE)
Resumen:
 Las superóxido dismutasas (SODs) son metaloproteínas que catalizan la detoxificación del radical superóxido, un subproducto inevitable de la respiración aeróbica. Estas enzimas se clasifican en función del cofactor metálico, siendo las SODs de Fe o Mn la forma evolutivamente más antigua. Estas se encuentran en bacterias y en organelas de eucariotes y muestran alta homología de secuencia, plegamientos similares e idéntica geometría del sitio activo. Funcionalmente, pueden diferenciarse en tres clases: las FeSODs, sólo activas con Fe; las MnSODs, sólo activas con Mn; y las Fe/MnSODs cambialísticas, que presentan actividad tanto con Fe como con Mn. La SOD de R. capsulatus (RcSOD) une preferentemente Mn y es más activa con este metal. Cuando la bacteria es crecida en condiciones aeróbicas, el porcentaje de MnSOD es del 90%, aunque en condiciones fotosintéticas disminuye a 60%. Con objeto de identificar determinantes estructurales de la selectividad de metal, se analizaron apilamientos de secuencias de enzimas de la familia Fe/MnSOD con diferente preferencia de metal, identificándose posiciones conservadas para cada tipo (Fe, Mn o cambialística)  construyéndose las mutantes puntuales C63S, F73R, S77A, A160P, G163T así como la deleción D(61-67). Tanto la enzima salvaje RcSOD como las mutantes fueron clonadas en el vector pES3228 para su expresión como proteínas recombinantes en E.coli. Se ensayaron protocolos de cultivo para optimizar la expresión soluble de la proteína recombinante, alcanzándose unos 6mg de proteína soluble por litro de cultivo. Las mutantes F73R y Del6167 no mostraron expresión soluble detectable en ninguna de las condiciones ensayadas. Para investigar el efecto de las mutaciones en la captura de metal in vivo, se indujo la expresión de las proteínas recombinantes en medio mínimo en presencia de FeSO4 o de MnSO4. Se realizaron geles de actividad SOD a pH 6 y 8, considerando que la forma FeSOD presenta una variación de actividad vs pH mucho mayor que la forma MnSOD. Si bien  las inducciones en presencia de MnSO4 no generaron diferencias entre proteína salvaje y mutantes,  los ensayos en presencia de Fe mostraron que sólo las mutantes A160P y G163T exhibieron diferencias respecto de la proteína salvaje sugiriendo que habrían unido una proporción menor de Fe. Estos resultados sugieren una influencia de residuos específicos en la selectividad de metal, la cual no estaría determinada exclusivamente por la disponibilidad de metal en el medio celular.