IBR   13079
INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
DETERMINANTES ESTRUCTURALES DE LA SELECTIVIDAD DE METAL DE LA SUPERÓXIDO DISMUTASA DE Rhodobacter capsulatus.
Autor/es:
DI CAPUA, CECILIA BEATRIZ; TABARES, LEANDRO CESAR; CORTEZ, NESTOR RICARDO
Lugar:
Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Reunión:
Congreso; Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Microbiología General (SAMIGE); 2007
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Microbiología General (SAMIGE)
Resumen:
Las superóxido
dismutasas (SODs) son metaloproteínas que catalizan la detoxificación del
radical superóxido, un subproducto inevitable de la respiración aeróbica. Estas
enzimas se clasifican en función del cofactor metálico, siendo las SODs de Fe o
Mn la forma evolutivamente más antigua. Estas se encuentran en bacterias y en
organelas de eucariotes y muestran alta homología de secuencia, plegamientos
similares e idéntica geometría del sitio activo. Funcionalmente, pueden
diferenciarse en tres clases: las FeSODs, sólo activas con Fe; las MnSODs, sólo
activas con Mn; y las Fe/MnSODs cambialísticas, que presentan actividad tanto
con Fe como con Mn.
La SOD de R. capsulatus
(RcSOD) une preferentemente Mn y es más activa con este metal. Cuando la
bacteria es crecida en condiciones aeróbicas, el porcentaje de MnSOD es del
90%, aunque en condiciones fotosintéticas disminuye a 60%. Con objeto de
identificar determinantes estructurales de la selectividad de metal, se
analizaron apilamientos de secuencias de enzimas de la familia Fe/MnSOD con
diferente preferencia de metal, identificándose posiciones conservadas para
cada tipo (Fe, Mn o cambialística)
construyéndose las mutantes puntuales C63S, F73R, S77A, A160P, G163T así
como la deleción D(61-67). Tanto la
enzima salvaje RcSOD como las mutantes fueron clonadas en el vector pES3228
para su expresión como proteínas recombinantes en E.coli. Se ensayaron protocolos de cultivo para optimizar la
expresión soluble de la proteína recombinante, alcanzándose unos 6mg de
proteína soluble por litro de cultivo. Las mutantes F73R y Del6167 no mostraron
expresión soluble detectable en ninguna de las condiciones ensayadas. Para
investigar el efecto de las mutaciones en la captura de metal in vivo, se indujo la expresión de las
proteínas recombinantes en medio mínimo en presencia de FeSO4 o de MnSO4. Se
realizaron geles de actividad SOD a pH 6 y 8, considerando que la forma FeSOD
presenta una variación de actividad vs pH mucho mayor que la forma MnSOD. Si
bien las inducciones en presencia de
MnSO4 no generaron diferencias entre proteína salvaje y mutantes, los ensayos en presencia de Fe mostraron que
sólo las mutantes A160P y G163T exhibieron diferencias respecto de la proteína
salvaje sugiriendo que habrían unido una proporción menor de Fe. Estos
resultados sugieren una influencia de residuos específicos en la selectividad
de metal, la cual no estaría determinada exclusivamente por la disponibilidad
de metal en el medio celular.