“Identificación y caracterización de mecanismos regulatorios de phla, la fosfolipasa B de Serratia marcescens.”

FEDRIGO, GRISELDA VALERIA; CASTELLI, MARÍA EUGENIA; GARCÍA VÉSCOVI, ELEONORA

Buenos Aires

Congreso; Congreso Argentino de Microbiología General, Sociedad Argentina de Microbiología General (SAMIGE); 2007

Sociedad Argentina de Microbiología General (SAMIGE)

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MECANISMOS REGULATORIOS DE PhlA, LA FOSFOLIPASA B DE Serratia marcescens. Fedrigo, Griselda V., Castelli, María E., García Véscovi, Eleonora. IBR-CONICET, Facultad de Ciencias. Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR. Suipacha 531, 2000 Rosario, Argentina. E-mail: fedrigo@ibr.gov.ar S. marcescens es un patógeno oportunista, causante de infecciones nosocomiales, las cuales pueden ser exacerbadas por la múltiple resistencia antibiótica que presenta este microorganismo. Además, la producción de varias proteínas extracelulares tales como nucleasa, proteasa, lipasa y hemolisina podrían contribuir a la adaptación de S. marcescens a distintos medios, así como a su potencial patogénico. Se ha demostrado que S. marcescens también produce una fosfolipasa denominada PhlA, cuya región promotora presenta un sitio de unión al factor sigma FliA y que requiere del flagelo para su secreción, pero aún se desconoce el rol fisiológico de esta exoenzima. En nuestro laboratorio, estamos abocados a la caracterización de factores involucrados en la virulencia de S. marcescens, así como también al estudio del mecanismo que utiliza esta bacteria oportunista para ingresar al hospedador. Mediante secuenciación y análisis de 16S rDNA, hemos caracterizado la cepa RM66262, proveniente de un aislamiento clínico, como Serratia marcescens y por cromatografía en capa delgada (TLC) demostramos que PhlA presenta actividad fosfolipasa de tipo B. Con el fin de identificar elementos regulatorios de la expresión de esta enzima, realizamos una mutagénesis al azar con el transposón Mini-Tn5 y rastreamos colonias deficientes en actividad fosfolipasa. A partir de este análisis aislamos tres clones independientes mutantes en el cluster wec, el cual codifica para proteínas involucradas en la biosíntesis de un glicolípido de membrana externa denominado Antígeno Común de Enterobacterias (ECA). Posteriormente, mediante ensayos de motilidad y RT-PCR en tiempo real, demostramos que las mutaciones en los genes wec son responsables de regular negativamente la transcripción de genes flagelares y de este modo controlar el ensamble del flagelo y la expresión de PhlA. Además para analizar el rol en la patogénesis de PhlA, realizamos ensayos in vitro y demostramos que esta fosfolipasa está involucrada en la invasión a células epiteliales. Por otra parte, las mutantes en los genes wec muestran un marcado defecto en su capacidad de invasión, que atribuimos a la simultánea deficiencia de ECA, defecto en el ensamble del flagelo y ausencia de PhlA.