Rápido ensayo microbiológico para caracterizar carbapenemasas en bacilos gram negativos.

MARCHIARO, P.; BALLERINI, V.; SPALDING, T.; CERA, G.; VILA, A.; VIALE, A.; ADRIANA SARA LIMANSKY

Córdoba

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología, AAM; 2007

Asociaci´´on Argentina de Microbiología

La adquisición de b-lactamasas capaces de hidrolizar carbapenemes, o carbapenemasas,  en bacilos gram-negativos causantes de infecciones intra-hospitalarias, constituye una problemática emergente en todo el mundo. Estas enzimas involucran b-lactamasas de clase B o metalo-b-lactamasas (MBLs) así como serino-b-lactamasas (SBLs) de las clases A y D de Ambler. Las primeras son inhibidas por agentes quelantes del Zn del sitio activo de las mismas, como EDTA; mientras que éstas últimas en su mayoría son inhibidas por ácido clavulánico (AC). La creciente diseminación de las mismas, así como la carencia de técnicas de referencia recomendadas por CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) para su detección nos impulsó a desarrollar métodos simples y rápidos que permitan caracterizar las cepas productoras de diferentes carbapenemasas. Hemos desarrollado un ensayo microbiológico apropiado para evaluar simultáneamente el perfil de sustratos como el de inhibidores de las carbapenemasas presentes en cepas productoras. Se emplean  extractos celulares de 15 cepas controles productoras de carbapenemasas. Los mismos fueron obtenidos mediante ruptura mecánica con partículas de vidrio o zirconio empleando bacterias desarrolladas en placa de cultivo, como alternativa al sonicado, evalúandose luego la actividad b-lactamasa de los extractos en ensayos microbiológicos. Para la selección de las condiciones de ruptura, se emplearon diferentes masas de partículas (entre 0,2 o 0,3 g), distintos volúmenes de buffer  (200 ml o 300 ml ) de resuspensión de 50 mg de peso húmedo de colonia y, por último 1,5; 3 o 6 min como tiempos de agitación. El ensayo microbiológico se basa en el desarrollo de una cepa indicadora en una placa de MH, a la que se le adicionan sustratos b-lactámicos (imipenem, meropenem y ceftazidima), y discos con los extractos celulares de cada cepa, con y sin los inhibidores específicos (AC y EDTA). Brevemente, se compara el desarrollo de la cepa indicadora alrededor del extracto con y sin inhibidor, lo que revela si el mismo presenta actividad frente a los diferentes sustratos, y la inhibición sobre los mismos. Se seleccionaron las siguientes condiciones para la obtención de extractos celulares: 0,3 g de perlas de vidrio y 200 ul de resuspensión bacteriana, sometidos a 3 min. de agitación, considerando aspectos económicos y rapidez técnica. El Ensayo Microbiológico conjuntamente con AC y EDTA, como Inhibidores es denominado EMBI. Así, la posibilidad de emplear extractos celulares obtenidos por métodos simples, rápidos y económicos facilita el empleo del ensayo para la caracterización apropiada de carbapenemasas. Se brindan así herramientas para futuras normativas de una rápida detección, esenciales para evitar fallas en los tratamientos a antimicrobianos. diferenciar MBLs de las SBLs y de esta manera prevenir su diseminación.