Evolución molecular dirigida de metalo-beta-lactamasas

PABLO E. TOMATIS Y ALEJANDRO J. VILA

San Nicolás, Buenos Aires, Argentina

Workshop; Segundo Workshop Argentino de Química Bioinorgánica; 2006

Las b-lactamasas son enzimas capaces de hidrolizar e inactivar a los antibióticos b-lactámicos. Las denominadas metalo-b-lactamasas (MBLs), presentan un motivo de unión a zinc en su sitio activo, esencial para la hidrólisis. Estas metaloenzimas poseen un amplio espectro de sustrato y hasta la fecha no han sido descriptos inhibidores efectivos de su actividad con aplicabilidad clínica. A pesar de mostrar diferencias funcionales entre sí, las MBLs producidas por distintos microorganismos están relacionadas evolutivamente, y los residuos de coordinación al Zn (II) se encuentran conservados. La enzima BcII de B. cereus (una bacteria del suelo no patogénica) posee una baja actividad respecto de otras MBLs aisladas de microorganismos patógenos. Este hecho nos llevó a postular a BcII como un precursor evolutivo de MBLs más eficientes. Para tratar de validar esta hipótesis, empleamos una metodología combinatorial iterativa de evolución molecular dirigida in vitro con  “DNA shuffling” para generar variantes de BcII con actividad incrementada. Luego de 4 ciclos, se aislaron clones que presentaron un incremento en resistencia a concentraciones de cefalexina de hasta 64 veces. Al analizar las secuencias de los clones mutados, no se encontratron mutaciones en los residuos ligandos del metal ni en las regiones de unión al sustrato. Se encontraron 4 residuos con alta frecuencia de mutación (N70S, V122A, L250S y G262S). Se eligio para su estudio la mutante denominada m5 aislada en la selección, la cual contiene solamente las cuatro mutaciones de mayor frecuencia. Al determinar las actividades hidrolíticas frente a varios sustratos, se encontró un selectivo incremento en la actividad de m5 vs. BcII frente a cefalexina, el sustrato utilizado en el proceso de selección. A su vez, al analizar la reacción de hidrólisis en estado pre-estacionario de estas enzimas se determinó que se logró aumentar selectivamente la actividad de BcII y que esto se debe a incrementos en kcat y no a cambios de afinidad por los sustratos. De manera de poder racionalizar los resultados obtenidos con la cuadruple mutante m5, se prepararon las mutantes simples (N70S y G262S) y la mutante doble N70S-G262S y se analizaron los parámetros enzimáticos de las mismas. Con el objeto de explorar la estructura del sitio metálico de las enzimas en estudio, nos valimos de las características espectroscópicas del ion Co(II). Para esto, se prepararon muestras de las 5 enzimas en las cuales el ion metálico Zn(II) se substituyó por Co(II). Al comparar estos resultados, se puede inferir que el perfil de la enzima mutante m5 seleccionada en el proceso de evolución dirigida estaría determinado por la mutación G262S. Interesantemente, el cambio de Gly262 por Ser se encuentra naturalmente en otras MBLs, incluyendo la enzima IMP-1 (plasmídica y de amplia distribución entre patógenos). En esta última, la mutación G262S resulta en un incremento en el espectro de sustratos hidrolizados. La mutación S262 actua como ligando de la segunda esfera de coordinación del Zn2, afectando la interacciones ligando-metal. Para poder analizar el posible cambio en la estabilidad de la enzimas mutantes con respecto a la enzima silvestre, se realizaron experimentos de desnaturalización con Cloruro de Guanidinio (GndCl). Estos experimentos indican que todas las mutantes tienen disminuida su estabilidad comparada con la enzima salvaje.