Caracterización funcional de proteínas de membrana externa involucradas en el transporte de imipenem en Acinetobacter baylyi

MORAN BARRIO, J; RELLING, V.; LIMANSKY, A.S.; BRAMBILLA, L; VIALE, A.M.

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología 2013; 2013

La proteína de membrana externa (PME) CarO pertenece a una nueva familia de PME presente solo en miembros de la familia Moraxellaceae de la clase Gammaproteobacteria. En el patógeno hospitalario Acinetobacter baumannii estas proteínas funcionan como canales de membrana externa (ME) para compuestos b-lactámicos carbapenemes como el imipenem (IPM) y aminoácidos básicos, con una marcada preferencia por la ornitina entre éstos últimos. En este trabajo evaluamos el rol del homólogo de CarO y de otras PME en A. baylyi como canales para IPM. Empleamos A. baylyi ADP1, microorganismo aislado del suelo y susceptible de manipulación genética, como representante del género. Construimos mutantes por deleción del gen carO (Delta-carO) en la cepa A. baylyi ADP1 y transformamos con el plásmido pVIM (codificante de blaVIM-11) que dirige la producción de esta metalo-b-lactamasa. Evaluamos luego las propiedades de canal de CarO para IPM y aminoácidos básicos en la mutante así como la cepa salvaje A. baylyi ADP1. Para ello, analizamos la cinética de degradación del IPM en células enteras en presencia y ausencia de diferentes compuestos competidores, incluyendo diferentes aminoácidos y poliaminas. Por su parte, el análisis del rol de canal de otras PME de A. baylyi fue realizada mediante concentración inhibitoria mínima (CIM) y ensayos de sensibilidad a SDS y NaCl. La cinética de ingreso de IPM en A. baylyi indicó la presencia de un sitio específico saturable en la ME a través del cual ocurre el ingreso a bajas concentraciones de IPM. Aminoácidos básicos como la arginina, ornitina, lisina e histidina fueron inhibidores efectivos del ingreso de IPM a células de A. baylyi, mientras que otros aminoácidos, incluyendo glutamato, glutamina, y poliaminas (como putrescina), no fueron capaces de inhibir el ingreso de IPM. Estos resultados sugieren que los miembros de la familia CarO de Acinetobacter funcionan fisiológicamente como canales específicos de la ME para aminoácidos básicos permitiendo así el ingreso de compuestos relacionados estructuralmente, como el IPM. Sin embargo, a concentraciones altas de IPM se observó el ingreso inespecífico a través de la ME sugiriendo la presencia de otros sitios. El análisis de 6 mutantes simples de A. baylyi carentes de PME del rango 25-36 kDa, reveló que la falta de CarO así como de una PME de 30 kDa resultó en una mayor tolerancia a NaCl o SDS, mientras que la falta de OmpA provocó una mayor sensibilidad a estos compuestos. Aun cuando fueron observados estos cambios, la CIM para IPM no se vio alterada en estas dos últimas mutantes, sugiriendo que estas PME no estarían involucradas en el ingreso de IPM. Estudios espectrofotométricos permitirán profundizar el rol de las mismas como canales para carbapenemes. Estos resultados muestran que CarO de A. baylyi constituye un homólogo funcional, siendo esta proteína un canal específico para aminoácidos básicos (e IPM) en el género Acinetobacter.