Cultivos organotipicos tipo raft: herramienta clave para el estudio de la biología de VPH y de los procesos neoplásicos asociados

BUGNON VALDANO MARINA; CAVATORTA AL; MARZIALI, FEDERICO; FACCIUTO FLORENCIA; BOCCARDO ENRIQUE; GARDIOL DANIELA

Buenos Aires

Congreso; XXXIII Reunión científica Anual de la SAV; 2013

Sociedad Argentina de Virologìa

Los papilomavirus humanos (VPH) infectan epitelios de una gran variedad de sitios anatómicos, y se clasifican como de bajo o alto riesgo, según las manifestaciones clínicas asociadas. La infección por VPH mucosotrópicos de alto riesgo es el evento clave en el desarrollo de los carcinomas de cuello de útero y de las lesiones neoplásicas precursoras. Los VPH infectan las células basales del epitelio estratificado y su ciclo de replicación está estrechamente coordinado con el programa de diferenciación de las células epiteliales, expresándose diferencialmente las distintas proteínas virales en los distintos estratos epiteliales. En nuestro laboratorio nos hemos abocado al estudio de la interferencia de las oncoproteínas de VPH con proteínas celulares involucradas en la transmisión de señales y en el mantenimiento de la polaridad celular, clave para la funcionalidad de los epitelios y cuya pérdida se asocia a la progresión de tumores. Sin embargo, dada la mencionada dependencia de la diferenciación del tejido infectado por parte de VPH, resulta imposible comprender los mecanismos moleculares asociados a la infección por dichos virus en un cultivo celular tradicional. En el presente trabajo desarrollamos cultivos epiteliales organotípicos tipo , los cuales reproducen fielmente el proceso de diferenciación epitelial in vitro. Para el desarrollo de los mencionados cultivos , queratinocitos primarios humanos comerciales se cultivaron permitiendo que dichas células proliferen y se diferencien totalmente, ordenándose en forma estratificada, en forma similar a los tejidos epiteliales escamosos. A su vez, dado que nuestro fin último es el estudio de la acción de las oncoproteínas virales sobre sus respectivos blancos celulares, obtuvimos cultivos con queratinocitos expresando, a partir de vectores retrovirales, las proteínas E6 y E7 de VPH de alto riesgo, como así también de bajo riesgo oncogénico. Las características morfológicas tisulares se analizaron en los tejidos obtenidos, encontrándose que únicamente ante la coexpresión de las proteínas E6 y E7 de VPH de alto riesgo, dichas características diferían de las que se observan para un epitelio normal. Así, ante la coexpresión de las oncoproteínas se observaron características de hiperproliferación, lo que no fue observado, como era esperado, en el caso del VPH de bajo riesgo oncogénico, habiéndose podido recrear en parte lo que ocurre ante un proceso carcinogénico in vivo. La expresión de E6 de VPH se confirmó en todos los casos tanto a nivel de los transcriptos por RT-PCR, como proteico mediante tecnología de ; mientras que confirmamos la expresión de los transcriptos correspondientes a E7 para cada tipo viral. En conclusión, la metodología aquí presentada nos permitirá validar y profundizar nuestros estudios de los mecanismos por los que las oncoproteínas de VPH interfieren con sus blancos celulares, particularmente aquellos asociados a la polaridad.