Caracterización de tres proteínas pertenecientes a la superfamilia metalo-b-lactamasa de salmonella typhimurium

VALERIA A. CAMPOS BERMUDEZ; FERNANDO C. SONCINI Y ALEJANDRO J. VILA

San Nicolas Bs As. Argentina

Workshop; Workshop Argentino de Metaloproteinas artificiales y complejos de coordinación biomiméticos; 2006

La superfamilia metalo-beta-lactamasa (MBL) está constituída por un gran número de proteínas con diferentes funciones biológicas. Aunque sus secuencias proteicas son altamente divergentes, los miembros de esta superfamilia comparten un dominio con plegamiento MBL y un sitio activo con un motivo de unión a dos iones metálicos. El plegamiento MBL consiste de un núcleo formado por dos hojas b apareadas las cuales están flanqueadas por dos hélices a expuestas al solvente (Carfi, et al. 1995). Muchas de estas proteínas poseen además dominios adicionales que les permiten llevar a cabo sus funciones específicas, ya sea para unión de sustrato o reconocimiento de cofactores. En el genoma de Salmonella typhimurium LT2 se identificaron once marcos abiertos de lectura anotados como miembros de la superfamilia MBL. Con el objetivo de explorar su potencialidad como moldes para la generación de enzimas con actividad MBL hemos seleccionado tres de estos marcos abiertos de lectura STM0261, STM0997 y STM3737. Las proteínas resultantes (GloB, YcbL y SSP respectivamente) fueron sobre-expresadas y purificadas. GloB: presenta alta homología de secuencia con la enzima glioxalasa II de diferentes organismos. Al ensayar la actividad de GloB frente a S-D-lactoilglutatión, se observó actividad glioxalasa II. Dicha actividad fue dependiente de la presencia de metales (Zn(II) y Fe(II)), observándose una significativa disminución de la misma ante el agregado de EDTA. YcbL: codifica para una proteína de función desconocida que posee 6 residuos putativos de unión a iones metálicos (4 His y 2 Asp). Los ensayo de contenido de metal por PAR y absorción atómica mostraron que YcbL une hasta 2 equivalentes de Zn(II) por mol de proteína. Mediante diversas técnicas espectroscópicas como EXAFS, titulación con Co(II) y RMN se determinó que el sitio de coordinación al Zn(II) en YcbL es similar al encontrado en distintos miembros de la superfamilia. SSP: SSP presenta en su secuencia sólo algunos de los residuos del motivo de unión a metal característico de los miembros de la superfamilia de las MBL. SSP no es capaz de unir metales. La ausencia del residuo de His118 dentro del motivo conservado de unión a metal, podría explicar la incapacidad de esta enzima de unir iones metálicos. Una mutante de SSP en la cual se reemplazó la Arg118 por un residuo de His es purificada con un equivalente de Zn(II) por proteína. Estos resultados indican que el cambio en sólo un residuo en la secuencia de SSP es capaz de generar un sitio de unión a metal.