Reducción de la eficiencia catalítica de la Ferredoxin-NADP(H) reductase de arveja mediante la incorporación de un sitio metálico artificial

CATALANO DUPUY, DANIELA L.; ORECCHIA, MARTÍN; RIAL, DANIELA V; CECCARELLI, EDUARDO A

San Nicolás, Buenos Aires

Workshop; 1º Workshop de Metaloproteínas Artificiales y Complejos de Coordinación Biomiméticos; 2006

Red de bioinorgánica

Las ferredoxina-NADP+ reductasas constituyen una familia de proteínas hidrofílicas monoméricas que contienen FAD no covalentemente unido como grupo prostético. Estas enzimas catalizan la transferencia de electrones reversible entre el NADP(H) y la proteína de Fe-S  ferredoxina (Fd) o la flavodoxina (Fld), la cual contiene FMN. La FNR de cloroplastos consiste de dos dominios estructurales, de aproximadamente 150 aminoácidos cada uno: el dominio que une FAD (N-terminal) y el dominio que une NADP+ (C-terminal). La participación de diferentes aminoácidos en la estructura y función de la enzima ha sido estudiada mediante la introducción de diferentes mutaciones y deleciones. En la FNR de arveja el FAD, responsable de la transferencia electrónica durante la catálisis, se encuentra interaccionando con tres tirosinas altamente conservadas (Y89, Y114 e Y308). La Tyr308 se encuentra enfrentando la cara re de la isoaloxacina, impidiendo su exposición con el exterior. La nicotinamida del NADP(H) desplazaría a la Tyr308 al fijarse a la enzima. Aunque existen evidencias al respecto, no existe una demostración experimental directa de este movimiento. Este particular mecanismo estaría involucrado en la generación de una enzima catalíticamente eficiente, aumentando la Km de la enzima para el NADP(H). Con el  fin de encontrar una evidencia experimental directa de este movimiento propuesto, se construyó una FNR recombinante en la cual el aminoácido carboxilo terminal (Tyr308) está seguido por un sitio metálico artificial compuesto de 9 aminoácidos entre los que se incluyen 4 residuos de histidina. Esta estructura adicionada es capaz de unir Zn2+ o Co2+ a bajas concentraciones, y como consecuencia, reduce fuertemente la eficiencia catalítica de la enzima. La afinidad de la enzima por NADP+ y la Km no fueron afectadas significativamente por el agregado de esta  extensión de aminoácidos tanto en ausencia como en presebcia de Zn2+. Los resultados obtenidos sugieren que la movilidad de la región carboxilo terminal de la FNR y principalmente la Tyr308, son esenciales para obtener una enzima altamente eficiente.