Fenotipo diferencial de la deficiencia de enzimas lipoiladas en bacterias Gram-positivas

MANSILLA MC; MARTIN, NATALIA; RUIZ, DM; DE MENDOZA, D

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología - CAM 2013; 2013

Asociación Argentina de Microbiología

El ácido lipoico es un cofactor organosulfurado que se encuentra ampliamente distribuido en la mayoría de los organismos procariotas y eucariotas. Es esencial para el funcionamiento de varias enzimas clave implicadas en el metabolismo oxidativo, incluyendo a los complejos piruvato deshidrogenasa (DH), α-cetoglutarato DH, DH de cetoácidos ramificados y acetoína DH, y el sistema de ruptura de la glicina. En los complejos DH el ácido lipoico se une específicamente a dominios proteicos presentes en la subunidad E2, lo mismo ocurre en el sistema de ruptura de la glicina, en el cual la proteína GcvH es la que se encuentra modificada por unión al cofactor. Las proteínas implicadas en la síntesis y utilización de ácido lipoico y las que dependen de este cofactor para su actividad han sido vinculadas con la patogénesis de distintos microorganismos. La vía de síntesis de ácido lipoico en bacterias Gram-positivas es más compleja que en Gram-negativas. En la bacteria modelo B. subtilis el octanoato proveniente del metabolismo lipídico es transferido desde ACP a la proteína GcvH mediante la acción de LipM, una octanoil-ACP:proteína-N-octanoiltransferasa. Posteriormente la GcvH:E2 amidotransferasa LipL, cataliza la transferencia de la porción octanoilo desde GcvH a las subunidades E2 de los complejos DH. Los dominios octanoilados son sustrato de LipA, que introduce dos átomos de azufre en la cadena hidrocarbonada del octanoilo unido a enzima. En la vía de utilización del lipoato proveniente del medio, éste es transferido a los dominios lipoilables en una reacción de dos pasos dependiente de ATP, catalizada por LplJ. Las mutantes ΔlipA, ΔlipM, ΔlipL y ΔgcvH de B. subtilis presentan una deficiencia en la lipoilación de los complejos DH que ocasiona defectos en el crecimiento en medio mínimo.  En este trabajo mostramos que además está afectada la capacidad de esporular. Para intentar definir qué deficiencia enzimática es la responsable del fenotipo de esporulación, construimos cepas en las cuales sólo algunas de las enzimas dependientes de ácido lipoico eran funcionales. Mediante reemplazo génico usando un casete de resistencia a espectinomicina construimos una mutante nula en la subunidad E2 de la DH de cetoácidos ramificados. La pérdida de dicha subunidad se comprobó mediante Western blot con anticuerpos anti-lipoato. Esta cepa fue capaz de crecer en medio mínimo sólo cuando fue suplementado con los precursores de los ácidos grasos ramificados, pero esporuló de manera similar a la cepa salvaje. Mediante ensayos de crecimiento en medio mínimo y Western blot comprobamos que una cepa ΔgcvH que expresa en trans la proteína homóloga de S. aureus puede lipoilar la piruvato DH, pero no las otras DH. Esta cepa no mostró fenotipo de esporulación. Estos resultados sugieren que el defecto en la esporulación observado en las mutantes en la síntesis de lipoato se debería a la falta de lipoilación de la piruvato DH.