Clonado y expresión parcial de la N-Acetil glucosaminidasa de embriones de Xenopus laevis.

MORALES, ENRIQUE S.; ARRANZ, SILVIA; CABADA MARCELO O.

Rosario

Congreso; VIII Congreso, XXVI Reunión anual de la Sociedad de Biología de Rosario.; 2006

Sociedad de Biología de Rosario.

Durante la fecundación se produce un reconocimiento específico entre las gametas provenientes de ambos sexos. Numerosos autores han propuesto que restos de carbohidratos de la matriz glicoproteica que rodea a los ovocitos, denominada envoltura vitelina (EV) en anfibios, estarían involucrados en el reconocimiento del espermatozoide y la inducción de la reacción acrosómica. Los ovocitos, una vez activados, liberan por exocitocis el contenido de los gránulos corticales y la EV se convierte en envoltura de fecundación (EF), impidiendo la poliespermia. En trabajos anteriores informamos que la actividad mas importante en extractos de ovocitos y espermatozoides de Bufo arenarum es la N-ac glucosaminidasa. También comprobamos que la N-ac glucosaminidasa de espermatozoides de B. arenarum es capaz de unirse a componentes de la envoltura vitelina de ovocitos provenientes de hembras de la misma especie; además, que en la conversión de la EV en EF son removidos restos de N-ac galactosamina, uno de los sustratos de la N-ac glucosaminidasa y que si se la compite disminuye el porcentaje de fecundación. Estos resultados, y otros similares obtenidos para otras especies, hacen de particular interés el estudio funcional y la caracterización de la N-ac glucosaminidasa presente en las gametas. En el presente trabajo se identificaron in-sílico EST´s que codifican la N-ac glucosaminidasa putativa de embriones de X. laevis. Los plásmidos que los contenían fueron cedidos por el Instituto Nacional de Biología Básica de Japón. La secuencia codificante se subclonó en distintos vectores de expresión procariotas (pQE31, pRSET y pGEX-3X) y se evaluó la expresión en E. coli para cada uno de ellos.  Los mejores resultados se obtuvieron con el vector pGEX-3X donde el fragmento amino terminal de la N-ac glucosaminidasa (~18 kDa) esta fusionado a GST. La purificación de la proteína recombinante se realizó con matriz de Glutation-Sepharose seguido de SDS-PAGE y electroelución. Obtuvimos un rendimiento de 0,350 microgramos de la fusión por mililitro de cultivo. Finalmente, con el objetivo de obtener anticuerpos que nos ayuden en la caracterización de la N-ac glucosaminidasa de B. arenarum, se realizó un protocolo de inmunización en conejo. El suero inmune proveniente del primer sangrado reconoció sólo el fragmento correspondiente a la N-ac glucosaminidasa y su título fue de 1/750 cuando utilizamos 0,150 mg de la fusión.