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Las metalo-β-lactamasas (MBLs), que confieren resistencia a un amplio espectro de antibióticos β-lactámicos y son resistentes a inhibidores de uso en la clínica, emplean uno o dos iones Zn(II) para la hidrólisis del anillo β-lactámico. Análisis de secuencia han identificado tres subclases: B1, B2 y B3. Entre éstas existen marcadas diferencias en la geometría de coordinación y en el número de iones Zn(II) esenciales para la catálisis. Las MBLs pertenecientes a la subclase B3 son enzimas binucleares en las que el Zn1 es coordinado por los residuos His116, His118, His196 y una molécula de H2O/OH- , mientras que como ligandos del Zn2 actúan los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua. En la MBL GOB, que ha sido clasificada como integrante de la subclase B3, el residuo His116 se encuentra sustituido por una Gln. GOB es las única MBL B3 que presenta un putativo entorno de coordinación diferente para el Zn(II). Por esto constituye un modelo útil para dilucidar relaciones entre estructura y mecanística enzimática. En este trabajo se caracteriza la MBL GOB-18, originaria de una cepa clínica de E. meningoseptica. GOB-18 recombinante purificada a partir del citoplasma de E. coli contiene 0,7 equivalentes de Fe/proteína y 0,2 equivalentes de Zn/proteína. Espectros de RMN y de EPR de GOB-18 indican la presencia de un único ion Fe(III) de alto spin localizado por molécula de enzima. Por otro lado, mediante espectroscopia de absorción de rayos X se determinó que los iones Fe(III) y Zn(II) presentes en GOB-18 presentan entornos de coordinación similares. Este conjunto de evidencias señala la presencia de un único ion por molécula de enzima, indica que los iones Fe(III) y Zn(II) se unen a un mismo sitio y valida el uso del ion Fe(III) como sonda espectroscópica en GOB-18. A partir de la especie apo-GOB-18 se reconstituyó la especie Zn(II)-GOB-18. El contenido de metal de la misma resultó de 1 equivalente de Zn/proteína. Los parámetros cinéticos obtenidos para Zn(II)-GOB-18 frente a distintos sustratos β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.β-lactamasas (MBLs), que confieren resistencia a un amplio espectro de antibióticos β-lactámicos y son resistentes a inhibidores de uso en la clínica, emplean uno o dos iones Zn(II) para la hidrólisis del anillo β-lactámico. Análisis de secuencia han identificado tres subclases: B1, B2 y B3. Entre éstas existen marcadas diferencias en la geometría de coordinación y en el número de iones Zn(II) esenciales para la catálisis. Las MBLs pertenecientes a la subclase B3 son enzimas binucleares en las que el Zn1 es coordinado por los residuos His116, His118, His196 y una molécula de H2O/OH- , mientras que como ligandos del Zn2 actúan los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua. En la MBL GOB, que ha sido clasificada como integrante de la subclase B3, el residuo His116 se encuentra sustituido por una Gln. GOB es las única MBL B3 que presenta un putativo entorno de coordinación diferente para el Zn(II). Por esto constituye un modelo útil para dilucidar relaciones entre estructura y mecanística enzimática. En este trabajo se caracteriza la MBL GOB-18, originaria de una cepa clínica de E. meningoseptica. GOB-18 recombinante purificada a partir del citoplasma de E. coli contiene 0,7 equivalentes de Fe/proteína y 0,2 equivalentes de Zn/proteína. Espectros de RMN y de EPR de GOB-18 indican la presencia de un único ion Fe(III) de alto spin localizado por molécula de enzima. Por otro lado, mediante espectroscopia de absorción de rayos X se determinó que los iones Fe(III) y Zn(II) presentes en GOB-18 presentan entornos de coordinación similares. Este conjunto de evidencias señala la presencia de un único ion por molécula de enzima, indica que los iones Fe(III) y Zn(II) se unen a un mismo sitio y valida el uso del ion Fe(III) como sonda espectroscópica en GOB-18. A partir de la especie apo-GOB-18 se reconstituyó la especie Zn(II)-GOB-18. El contenido de metal de la misma resultó de 1 equivalente de Zn/proteína. Los parámetros cinéticos obtenidos para Zn(II)-GOB-18 frente a distintos sustratos β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.β-lactámicos y son resistentes a inhibidores de uso en la clínica, emplean uno o dos iones Zn(II) para la hidrólisis del anillo β-lactámico. Análisis de secuencia han identificado tres subclases: B1, B2 y B3. Entre éstas existen marcadas diferencias en la geometría de coordinación y en el número de iones Zn(II) esenciales para la catálisis. Las MBLs pertenecientes a la subclase B3 son enzimas binucleares en las que el Zn1 es coordinado por los residuos His116, His118, His196 y una molécula de H2O/OH- , mientras que como ligandos del Zn2 actúan los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua. En la MBL GOB, que ha sido clasificada como integrante de la subclase B3, el residuo His116 se encuentra sustituido por una Gln. GOB es las única MBL B3 que presenta un putativo entorno de coordinación diferente para el Zn(II). Por esto constituye un modelo útil para dilucidar relaciones entre estructura y mecanística enzimática. En este trabajo se caracteriza la MBL GOB-18, originaria de una cepa clínica de E. meningoseptica. GOB-18 recombinante purificada a partir del citoplasma de E. coli contiene 0,7 equivalentes de Fe/proteína y 0,2 equivalentes de Zn/proteína. Espectros de RMN y de EPR de GOB-18 indican la presencia de un único ion Fe(III) de alto spin localizado por molécula de enzima. Por otro lado, mediante espectroscopia de absorción de rayos X se determinó que los iones Fe(III) y Zn(II) presentes en GOB-18 presentan entornos de coordinación similares. Este conjunto de evidencias señala la presencia de un único ion por molécula de enzima, indica que los iones Fe(III) y Zn(II) se unen a un mismo sitio y valida el uso del ion Fe(III) como sonda espectroscópica en GOB-18. A partir de la especie apo-GOB-18 se reconstituyó la especie Zn(II)-GOB-18. El contenido de metal de la misma resultó de 1 equivalente de Zn/proteína. Los parámetros cinéticos obtenidos para Zn(II)-GOB-18 frente a distintos sustratos β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.β-lactámico. Análisis de secuencia han identificado tres subclases: B1, B2 y B3. Entre éstas existen marcadas diferencias en la geometría de coordinación y en el número de iones Zn(II) esenciales para la catálisis. Las MBLs pertenecientes a la subclase B3 son enzimas binucleares en las que el Zn1 es coordinado por los residuos His116, His118, His196 y una molécula de H2O/OH- , mientras que como ligandos del Zn2 actúan los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua. En la MBL GOB, que ha sido clasificada como integrante de la subclase B3, el residuo His116 se encuentra sustituido por una Gln. GOB es las única MBL B3 que presenta un putativo entorno de coordinación diferente para el Zn(II). Por esto constituye un modelo útil para dilucidar relaciones entre estructura y mecanística enzimática. En este trabajo se caracteriza la MBL GOB-18, originaria de una cepa clínica de E. meningoseptica. GOB-18 recombinante purificada a partir del citoplasma de E. coli contiene 0,7 equivalentes de Fe/proteína y 0,2 equivalentes de Zn/proteína. Espectros de RMN y de EPR de GOB-18 indican la presencia de un único ion Fe(III) de alto spin localizado por molécula de enzima. Por otro lado, mediante espectroscopia de absorción de rayos X se determinó que los iones Fe(III) y Zn(II) presentes en GOB-18 presentan entornos de coordinación similares. Este conjunto de evidencias señala la presencia de un único ion por molécula de enzima, indica que los iones Fe(III) y Zn(II) se unen a un mismo sitio y valida el uso del ion Fe(III) como sonda espectroscópica en GOB-18. A partir de la especie apo-GOB-18 se reconstituyó la especie Zn(II)-GOB-18. El contenido de metal de la misma resultó de 1 equivalente de Zn/proteína. Los parámetros cinéticos obtenidos para Zn(II)-GOB-18 frente a distintos sustratos β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.2O/OH- , mientras que como ligandos del Zn2 actúan los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua. En la MBL GOB, que ha sido clasificada como integrante de la subclase B3, el residuo His116 se encuentra sustituido por una Gln. GOB es las única MBL B3 que presenta un putativo entorno de coordinación diferente para el Zn(II). Por esto constituye un modelo útil para dilucidar relaciones entre estructura y mecanística enzimática. En este trabajo se caracteriza la MBL GOB-18, originaria de una cepa clínica de E. meningoseptica. GOB-18 recombinante purificada a partir del citoplasma de E. coli contiene 0,7 equivalentes de Fe/proteína y 0,2 equivalentes de Zn/proteína. Espectros de RMN y de EPR de GOB-18 indican la presencia de un único ion Fe(III) de alto spin localizado por molécula de enzima. Por otro lado, mediante espectroscopia de absorción de rayos X se determinó que los iones Fe(III) y Zn(II) presentes en GOB-18 presentan entornos de coordinación similares. Este conjunto de evidencias señala la presencia de un único ion por molécula de enzima, indica que los iones Fe(III) y Zn(II) se unen a un mismo sitio y valida el uso del ion Fe(III) como sonda espectroscópica en GOB-18. A partir de la especie apo-GOB-18 se reconstituyó la especie Zn(II)-GOB-18. El contenido de metal de la misma resultó de 1 equivalente de Zn/proteína. Los parámetros cinéticos obtenidos para Zn(II)-GOB-18 frente a distintos sustratos β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.mientras que como ligandos del Zn2 actúan los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua. En la MBL GOB, que ha sido clasificada como integrante de la subclase B3, el residuo His116 se encuentra sustituido por una Gln. GOB es las única MBL B3 que presenta un putativo entorno de coordinación diferente para el Zn(II). Por esto constituye un modelo útil para dilucidar relaciones entre estructura y mecanística enzimática. En este trabajo se caracteriza la MBL GOB-18, originaria de una cepa clínica de E. meningoseptica. GOB-18 recombinante purificada a partir del citoplasma de E. coli contiene 0,7 equivalentes de Fe/proteína y 0,2 equivalentes de Zn/proteína. Espectros de RMN y de EPR de GOB-18 indican la presencia de un único ion Fe(III) de alto spin localizado por molécula de enzima. Por otro lado, mediante espectroscopia de absorción de rayos X se determinó que los iones Fe(III) y Zn(II) presentes en GOB-18 presentan entornos de coordinación similares. Este conjunto de evidencias señala la presencia de un único ion por molécula de enzima, indica que los iones Fe(III) y Zn(II) se unen a un mismo sitio y valida el uso del ion Fe(III) como sonda espectroscópica en GOB-18. A partir de la especie apo-GOB-18 se reconstituyó la especie Zn(II)-GOB-18. El contenido de metal de la misma resultó de 1 equivalente de Zn/proteína. Los parámetros cinéticos obtenidos para Zn(II)-GOB-18 frente a distintos sustratos β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.E. meningoseptica. GOB-18 recombinante purificada a partir del citoplasma de E. coli contiene 0,7 equivalentes de Fe/proteína y 0,2 equivalentes de Zn/proteína. Espectros de RMN y de EPR de GOB-18 indican la presencia de un único ion Fe(III) de alto spin localizado por molécula de enzima. Por otro lado, mediante espectroscopia de absorción de rayos X se determinó que los iones Fe(III) y Zn(II) presentes en GOB-18 presentan entornos de coordinación similares. Este conjunto de evidencias señala la presencia de un único ion por molécula de enzima, indica que los iones Fe(III) y Zn(II) se unen a un mismo sitio y valida el uso del ion Fe(III) como sonda espectroscópica en GOB-18. A partir de la especie apo-GOB-18 se reconstituyó la especie Zn(II)-GOB-18. El contenido de metal de la misma resultó de 1 equivalente de Zn/proteína. Los parámetros cinéticos obtenidos para Zn(II)-GOB-18 frente a distintos sustratos β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.E. coli contiene 0,7 equivalentes de Fe/proteína y 0,2 equivalentes de Zn/proteína. Espectros de RMN y de EPR de GOB-18 indican la presencia de un único ion Fe(III) de alto spin localizado por molécula de enzima. Por otro lado, mediante espectroscopia de absorción de rayos X se determinó que los iones Fe(III) y Zn(II) presentes en GOB-18 presentan entornos de coordinación similares. Este conjunto de evidencias señala la presencia de un único ion por molécula de enzima, indica que los iones Fe(III) y Zn(II) se unen a un mismo sitio y valida el uso del ion Fe(III) como sonda espectroscópica en GOB-18. A partir de la especie apo-GOB-18 se reconstituyó la especie Zn(II)-GOB-18. El contenido de metal de la misma resultó de 1 equivalente de Zn/proteína. Los parámetros cinéticos obtenidos para Zn(II)-GOB-18 frente a distintos sustratos β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.β-lactámicos resultaron muy similares a los previamente reportados para GOB-1 (Bellais et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.et al, 2000). Se generó la mutante puntual Q116H de GOB-18. El contenido de metal, propiedades cinéticas y espectros de RMN de GOB-Q116H resultaron muy similares a los mismos obtenidos para la especie salvaje. Espectros de absorción de rayos X no mostraron presencia de un ligando His adicional. Estos resultados evidencian que el residuo Q116 no es ligando del ion metálico, que se uniría entonces al putativo sitio 2 de GOB-18. Esto se confirmó al estudiar otra mutante puntual: GOB-D120S. Dicha especie presenta contenido metálico y capacidades catalíticas muy reducidas con respecto a la especie salvaje. De estos estudios se concluye que: a) GOB-18 uniría un único ion metálico en el putativo sitio 2, formado por los residuos Asp120, His121, His263 y a una o dos moléculas de agua; b) la especie Zn(II)-GOB-18 presenta parámetros cinéticos similares a los previamente reportados para otra variante de GOB; c) el residuo Asp120 es ligando del ion metálico presente en GOB-18 y es esencial para su actividad.