Caracterización de la interacción de los reguladores transcripcionales GodS y CueR con sus genes blanco en Salmonella

PODOROSKA, B. M.; PÉREZ AUDERO, M. E.; SONCINI, F. C.

Rosario, Argentina

Congreso; VIII Congreso y XXVI Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2006

Sociedad de Biología de Rosario

La familia MerR comprende un grupo de reguladores transcripcionales que responden específicamente a una variedad de estímulos ambientales, tales como metales pesados, estrés oxidativo o antibióticos. En nuestro laboratorio ha sido caracterizado un locus específico de Salmonella, que codifica para un regulador de tipo MerR (GodS), con alta homología con CueR, el regulador que responde a cobre, una ATPasa transportadora de metal (GodT), y un polipéptido homólogo a chaperonas de cobre (GodB). Demostramos que este sistema está involucrado en el monitoreo y detoxificación de oro. A su vez, Salmonella posee el sistema ancestral de detoxificación de cobre, constituído por CueR, la ATPasa CopA y una oxidasa multicobre CuiD. Determinamos mediante ensayos de extensión del cebador y de huella dactilar con DNasa I los sitios de reconocimiento de GodS en los promotores de godB y godTS, que llamativamente son muy similares a los reconocidos por CueR. Mediante ensayos in vitro de retardo de la movilidad electroforética en geles (EMSA) y de huella dactilar con DNasa I observamos que los reguladores GodS y CueR son capaces de interaccionar no sólo con sus genes blanco (godTS y godB para GodS, y copA y cuiD para CueR) sino también con los promotores de los genes del otro regulón, aunque con una afinidad marcadamente menor. De hecho, cada regulador tiene la capacidad de discriminar entre sus promotores blanco, a los cuales se une preferentemente, y aquellos con los que interacciona con menor afinidad. Esta observación, junto con la expresión de los reporteros de ambos regulones sugiere la existencia de una posible regulación cruzada entre los dos sistemas. Esto se pudo evidenciar in vivo sólo en ausencia de cada uno de los dos reguladores. Realizamos un análisis in silico de los promotores reconocidos por GodS y por CueR (SctR de Salmonella) y observamos la presencia putativa de bases específicas para cada regulador. Analizamos estas bases como determinantes de especificidad y/o afinidad a través de la construcción de mutaciones sitio-dirigidas en los promotores de godB y copA. Mediante medidas de actividad  galactosidasa del gen reportero lacZ fusionado a estos promotores mutantes, y ensayos de interacción in vitro de los promotores con los reguladores GodS y CueR identificamos bases directamente involucradas en el reconocimiento selectivo de cada promotor por su regulador correspondiente.