CARACTRIZACIÓN MOLECULAR DE LA HEXOSAMINIDASA DE Xenopus: DESDE EL GEN A SUS POLIPÉPTIDOS ESTRUCTURALES.

MORALES E S; KRAPF D; BOTTA P; ARRANZ SE

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2012

Las glicosidasas son enzimas involucradas en la fecundación de una gran diversidad de especies animales. Se ha propuesto que participan no sólo en la unión de las gametas sino además, en la prevención de la polispermia y en la interacción del espermatozoide con la envoltura de los ovocitos (zona pelúcida en mamíferos o envoltura vitelina en anfibios). Entre las glicosidasas, la N-acetilglucosaminidasa (Hexosaminidasa o Hex) ha sido vinculada a la fecundación de los anfibios (B. arenarum y X. laevis). Esta enzima remueve residuos N-acetil-glucosamina (NacGlc) o N-acetilgalactosamina (NacGal) terminales desde glicoconjugados. En los mamíferos han sido caracterizadas tres isoformas de la Hex; cada una formada por la homo o heterodimerización de dos subunidades distintas denominadas A y B: HexA (AB), HexB (BB) y HexS (AA). Ambas subunidades presentan un sitio activo y son sintetizadas desde genes ubicados en distintos cromosomas (HEXA (subunidad A) y HEXB (subunidad B)), que se cree evolucionaron a partir de un gen ancestral común. Todas las isoformas de la Hex pueden hidrolizar residuos NacGlc o NacGal terminales desde sustratos neutros, pero sólo las isoformas A y S pueden hidrolizar sustratos negativamente cargados; como aquellos que contienen grupos sulfato o ácido siálico. En las Hexs de humanos estas diferencias son atribuidas a los únicos dos residuos de aminoácidos del sitio activo que difieren entre las subunidades A y B. Mientras el sitio activo de la subunidad α presenta una Arg que es crítica para la unión de grupos negativamente cargados, la subunidad β presenta un Asp que repele estos sustratos, permitiendo sólo la ruptura eficiente de sustratos neutros. A pesar de este profundo conocimiento sobre las Hexs de los mamíferos nada se conocía sobre las Hexs de anfibios. El objetivo del presente trabajo fue abordar la caracterización de la Hex de Xenopus, tanto a nivel genómico como molecular, para obtener datos estructurales sobre su composición y del origen de sus polipéptidos. En nuestro laboratorio previamente secuenciamos una putativa Hex de X. laevis (GenBank JN127371). En este trabajo, nosotros utilizamos esta secuencia para buscar por homología genes que codificasen putativas Hexs en el genoma de X. tropicalis (~90% secuenciado). Un único gen fue encontrado. Sin embargo, una búsqueda por homología utilizando cDNAs de marco de lectura abierto (ORF) completo mostró que dos ARNms(GenBank BC161740 y BC161249) podían ser transcriptos desde él (Fig. 1A). El análisis in-silico de los polipéptidos codificados en estos transcritos mostró que ambos polipéptidos presentaban todas las características estructurales encontradas en las Hexs actualmente caracterizadas; incluyendo las cisteínas involucradas en enlaces disulfuro, los sitios putativos de N-glicosilación y los todos los residuos de aminoácido que componen su sitio activo. El alineamiento de estos polipéptidos mostró una elevada identidad entre ellos (~95%) excepto en la región polipeptídica que contiene los dos residuos de aminoácidos variables que definen el sitio activo de las Hexs como A o B. En este sentido fue encontrado que uno de los polipéptidos (codificado en BC161249) presentaba un sitio activo de tipo α (conservando la Arg) mientras que el otro (codificado en BC161740) presentaba un sitio activo de tipo B (conservando el Asp). Llamativamente, estas regiones polipeptídicas disimiles estaban codificadas en dos exones del mismo gen encontrado. Un análisis por homología realizado contra los genes HEXA y HEXB de humanos mostró que el fragmento polipeptídico codificado en el exon que define el sitio activo como A en Xenopus era homólogo al fragmento polipeptídico codificado en el exon que define el sitio activo como A en HEXA, mientras que el fragmento polipeptídico codificado en el exon que define el sitio activo como B en Xenopus era homólogo al fragmento polipeptídico codificado en el exon que define el sitio activo como Bβ en HEXB. Resultados similares fueron encontrados en X. laevis (Fig. 1C). Un estudio de los intrones vecinos a estos exones mostró la conservación en sus secuencias de los sitios dadores (GT; GU en el ARNm) y aceptores (AG) de splicing, aportando evidencia sobre la conservación de su funcionalidad (Fig. 1B). De este modo un estudio de Southern blot (Fig. 2) fue realizado para verificar la factibilidad de que los polipéptidos encontrados (A y B) pudiesen verdaderamente ser codificados en el mismo locus génico. Para ello ADN genómico de X. laevis fue digerido a complexión con las enzimas de restricción AvaII; o BstXI; o EcoRI; o HindIII; o NcoI. Los digeridos fueron separadamente resueltos en gel de agarosa, transferidos a una membrana de Nylon e hibridados con una sonda complementaria a la secuencia del primer exon del gen de la Hex de Xenopus encontrado. Este exon está representado en los dos ARNms que son predichos ser transcripto desde él, y que codifican para los polipéptidos α o β. Tres bandas de hibridación fueron vistas en los digeridos provenientes de las enzimas AvaII, EcoRI y HindIII. Sin embargo, sólo una banda de hibridación fue detectada en el caso de los digeridos con BstXI y NcoI. Nuestros resultados demuestran que en Xenopus los polipéptidos A y B que constituyen las distintas isoformas de las Hexs podrían ser sintetizados por splicing alternativo desde un mismo gen; mostrando una marcada diferencia evolutiva con los mamíferos donde estos polipéptidos son sintetizados a partir de genes diferentes.