Estudio del rol del sistema de dos componentes YvfTU de Bacillus subtilis en la percepción de cambios de temperatura

PORRINI, L; FERNÁNDEZ, P; ALBANESI, D; DE MENDOZA, D; MANSILLA, MC

Rosario

Jornada; VI Jornada de Ciencia y Tecnología UNR; 2012

Univ. Nac. de Rosario

        Bacillus subtilis posee un mecanismo de adaptación al frío, denominado circuito Des, que regula la síntesis de ácidos grasos insaturados. La expresión del gen des, que codifica para una delta5 acil-lípido desaturasa, se encuentra regulada por un sistema de dos componentes (TCS) constituido por una histidina quinasa asociada a membrana, DesK, y por un activador transcripcional soluble, DesR. Cuando se produce una disminución en la temperatura DesK actúa como quinasa fosforilando a DesR, el cual una vez fosforilado activa la transcripción de des. La desaturasa introduce dobles enlaces en las cadenas de acilo de los fosfolípidos, generando una membrana más fluida. En estas condiciones DesK adopta un estado fosfatasa, defosforila a DesR y silencia así la transcripción de des. En nuestro laboratorio se encontró que B. subtilis posee un TCS, YvfT-YvfU, que presenta homología con DesK-DesR. Ya que hasta el momento se desconocen las señales a las cuales responde este sistema, el objetivo  de este trabajo es determinar si la quinasa YvfT responde también a señales de disminución de temperatura.Mediante medidas de actividad β-galactosidasa se determinó que la expresión del transportador de tipo ABC, YvfRS, cuyos genes codificantes se encuentran corriente arriba de yvfT e yvfU, está regulada por YvfTU, ya que una mutante nula en este TCS fue incapaz de expresar la fusión reporteraPyvfR-lacZ. Con el fin de comprobar si YvfT es capaz de percibir cambios de temperatura se analizó si esta putativa quinasa era capaz de complementar in vivo mutantes deficientes en desK. Para este fin, se expresóYvfT bajo un promotor inducible por xilosa (Pxyl) en una cepa B. subtilis mutante nula en DesK (desK-) y que contiene una fusión transcripcional del Pdes-lacZ. Los resultados de las medidas de actividad beta-galactosidasa en esta cepa mostraron que la expresión de YvfT no recupera la habilidad de la mutante de transcribir el gen des a baja temperatura. En principio este resultado podría deberse a que YvfT no se activara por las mismas señales que DesK, o que no se estuviera expresando o que si se expresaba no fuera funcional, ya que la secuencia de YvfT presenta varios residuos de Met muy cercanos que podrían funcionar como inicios de la traducción. Para confirmar que YvfT se expresara, se realizaron ensayos de Western blot con anticuerpos anti-DesKC (dominio citoplasmático soluble de DesK) de las proteínas de membrana de las cepas DesK- complementadas con YvfT. En este ensayo no se detectó la presencia de la banda correspondiente a YvfT, lo que no nos permite definir si  la putativa quinasa no se expresa o los anticuerpos anti-DesKC no la reconocen. Por tal motivo, se expresará in vivo una versión fusionada a una cola de histidinas bajo control del Pxyl (Pxyl-yvfT-His6) la cual será posteriormente identificada mediante Western blot con anticuerpos anti-His. Para confirmar si el inicio de traducción usado es el correcto, se complementará una mutante B. subtilis yvfTU-con el vector de expresión pHPKS (Pxyl-yvfTU). Si la expresión de yvfTU en trans recupera la habilidad de la mutante de transcribir el gen blanco yvfRse confirmará la funcionalidad de la construcción en el vector de expresión. Si lo anterior no ocurre se procederá a clonar yvfT a partir de un sitio diferente de iniciación de la traducción. Una vez confirmado que YvfT se expresa como una proteína activa se podrá definir si el sistema YvfT-YvfU es capaz de responder a cambios en la temperatura. La posterior comparación de ambas quinasas (YvfT y DesK) nos permitirá inferir cuáles serían los aminoácidos esenciales para la detección y la transducción de la señal de frío en DesK.