IBR   13079
INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Identificación del HPV-156, el prototipo de una nueva especie del género gama-papillomavirus, mediante una estrategia de PCR genérica y altamente sensible para fragmentos largos de ADN
Autor/es:
BOLATTI, ELISA; PICCIRILLI, GUSTAVO; QUATTROCCHI, CRISTIAN; SANCHEZ, ADRIANA; FERNANDEZ BUSSY, RAMÓN; GIRI ADRIANA A; CHOUHY, DIEGO
Lugar:
Rosario
Reunión:
Congreso; XIV Congreso y XXXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2012
Institución organizadora:
Sociedad de Biología de Rosario
Resumen:
La familia Papillomaviridae incluye un grupo heterogéneo de virus epiteliotrópicos sin envoltura y con genoma de ADN doble hebra circular de aproximadamente 8 kpb. Los papillomavirus (PV) han sido clasificados en base a la identidad nucleotídica del gen que codifica para la proteína mayor de la cápside L1 (ORF L1) en géneros (<60% de identidad nucleotídica), especies (<70% de identidad nucleotídica) y tipos (<90% de identidad nucleotídica). Actualmente se han caracterizado más de 150 tipos de PV Humanos (HPV), los cuales han sido agrupados en los géneros Alfa-, Beta-, Gama-Mu- y Nu -PV. Los HPV que infectan epitelios mucosos pertenecen al género Alfa-PV e incluyen más de 40 tipos, algunos de los cuales son los agentes causantes del cáncer anogenital. Los HPV cutaneotrópicos son más heterogéneos y están distribuidos en los 5 géneros que agrupan a los HPV. Su gran diversidad genética ha dificultado su identificación y el estudio de un posible rol viral en la carcinogénesis cutánea. Además, se han identificado más de 200 potenciales tipos nuevos, en su mayoría en piel, de los cuales se conocen sólo fragmentos genómicos parciales y se ignoran las implicancias clínicas de sus infecciones. Si bien los esfuerzos para caracterizar estos potenciales nuevos virus han sido considerables, hasta la fecha sólo se han reportado los genomas completos de menos del  25% de ellos.En este trabajo se describe una estrategia genérica y altamente sensible para facilitar la identificación de nuevos HPV, denominada “PCR de la gota colgante para fragmentos largos”. Esta estrategia consiste en la amplificación de 2 fragmentos de aproximadamente 4.000 pb cada uno con extremos solapantes entre sí utilizando cebadores genéricos y una variación de PCR anidada denominada “PCR de la gota colgante”. En particular presentamos su aplicación para la amplificación de tipos de HPV del género altamente divergente, Gama-PV. Para lograr este objetivo, se realizó un alineamiento del gen E1 de todos los Gama-PV conocidos para el diseño de cebadores genéricos. Posteriormente, los cebadores de la región E1 se combinaron con los cebadores genéricos FAP que hibridan en la región L1 y considerados de referencia para HPV cutàneos. En primer lugar se optimizaron las condiciones de amplificación de la “PCR de la gota colgante para fragmentos largos” utilizando el sistema Expand Long Range dNTPack (Roche, Buenos Aires, Argentina) que permite amplificar con alta eficiencia y fidelidad fragmentos de hasta 20 Kpb y un plásmido conteniendo el genoma completo del HPV-4 (Gama-PV especie 1). La nueva metodología permitió obtener bandas visibles de 4 Kpb luego de electroforesis en gel de agarosa al 1% a partir de 10 copias de HPV-4/reacción, resultando ser 100 veces más sensible que la amplificación por PCR simple de fragmentos largos con los mismos cebadores. Sucesivamente, analizamos 19 muestras clínicas conteniendo potenciales tipos nuevos del Gama-PV previamente identificados en un estudio realizado por nuestro grupo que condujo a la identificación del primer HPV a ser reportado en Sudamérica, HPV-115. La nueva estrategia logró identificar 5 fragmentos de aproximadamente 4 Kpb correspondientes a HPV-23 (Beta-PV especie 2) y a 4 potenciales tipos nuevos del Gama-PV (GC01, GC10, GC23 y GC24). Posteriormente, procedimos a caracterizar el genoma completo del tipo potencial GC01, identificado en una muestra de piel sana de una zona expuesta al sol derivada de un paciente inmunocompetente con queratosis seborreica. Para obtener la otra mitad genómica, se aplicó la misma estrategia precedente utilizando cebadores específicos diseñados a partir del fragmento conocido de 4 Kpb del GC01. De esta manera fue posible obtener el genoma completo de un nuevo virus, denominado HPV-156 (Número de acceso a GenBank JX429973), el cual fue secuenciado completamente. El nuevo virus tiene un genoma de 7.329 bp y presenta la organización genómica típica de los Gama-PV, codificando para 5 genes tempranos (E6, E7, E1, E2 y E4), 2 genes tardíos (L2 y L1) y ausencia del ORF E5. Se procedió a explorar las relaciones filogenéticas de HPV-156. Se realizaron alineamientos múltiples de los ORF L1 de todos los tipos pertenecientes a los distintos géneros donde se hallan agrupados los HPV con el programa Mega 5. Las relaciones filogenéticas fueron inferidas con análisis Bayesiano utilizando el programa Beast version 1.6.2. El análisis filogenético confirmó al HPV-156 como un nuevo miembro del género Gama-PV y estaría, filogenéticamente relacionado con el HPV-60 (Gama-PV especie 4), con el cual comparte un 67,3% de identidad nucleotídica en el L1 ORF (Figura 1). Sin embargo, y teniendo en cuenta los actuales criterios de clasificación taxonómica para la asignación de especie (<70% de identidad nucleotídica respecto a cualquier otro tipo previamente reportado), el HPV-156 sería el prototipo de una nueva especie dentro del género Gama-PV (Figura 1, γ-Un). En conclusión, este trabajo describe una estrategia versátil y con una mayor sensibilidad que los métodos de amplificación convencionales para fragmentos largos que permitió identificar y caracterizar un nuevo virus, el HPV-156, prototipo de una nueva especie dentro del género Gama-PV. Esta técnica podría además, extrapolarse a otros géneros de la familia Papillomaviridae a fin de facilitar la caracterización de los potenciales tipos de HPV por descubrir a fin de dilucidar el rol de estos virus en las infecciones que cursan en distintos epitelios.