Identificación de nuevos tipos de HPV por una nueva estrategia de PCR genérica y altamente sensible para fragmentos largos de ADN

BOLATTI E; CHOUHY D; PEREZ GR; PICCIRILLI G; QUATTROCCHI C; FERNANDEZ BUSSY R JR; SÁNCHEZ A; FERNANDEZ BUSSY R; GIRI AA

Valle Hermoso

Encuentro; Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología 2012; 2012

Sociedad Argentina de Virología

Los papilomavirus (PV) son virus epiteliotrópicos con genoma de ADN doble hebra circular de aproximadamente 8 Kpb, sin envoltura y muy heterogéneos. Por convención un nuevo tipo de PV posee menos del 90% de identidad nucleotídica en el gen L1 respecto a cualquier otro tipo conocido, mientras que los PV pertenecientes a una nueva especie comparten entre el 60%-70% de identidad nucleotídica respecto a tipos de PV pertenecientes a otras especies conocidas. Al momento se han descripto más de 150 tipos en humanos (HPV), 75% asociados a infecciones de piel. Los HPV cutaneotrópicos se distribuyen en 5 géneros (Alfa-, Beta-, Gama-, -Mu y Nu-PV) y la evidencia científica es inconcluyente sobre su rol en la carcinogénesis cutánea. Entre los HPV identificados en piel, los del género Gama-PV parecen ser particularmente divergentes. Si bien se han descripto más de 30 Gama-PV en humanos, se hipotetiza la existencia de un número mayor dada la gran cantidad de tipos potenciales identificados de los cuales sólo se conoce un fragmento genómico. Para avanzar en el conocimiento de la familia Papillomaviridae es necesario identificar y caracterizar los genomas completos de los tipos potenciales de Gama-PV a fin de dilucidar la evolución y las implicancias médicas de estos virus. En este trabajo se describe una estrategia genérica y altamente sensible para facilitar la identificación de nuevos PV, denominada "PCR de la gota colgante para fragmentos largos". Esta estrategia consiste en la amplificación de 2 fragmentos de aproximadamente 4 kpb con extremos solapantes entre sí utilizando cebadores genéricos del Gama-PV en la región E1 y L1, y PCR de la gota colgante, una variación de PCR anidada. La nueva metodología fue 100 veces más sensible que la amplificación por PCR simple de fragmentos largos. La aplicación de la nueva metodología en 19 muestras de piel conteniendo nuevos tipos potenciales del Gama-PV permitió identificar fragmentos de aproximadamente 4 Kpb correspondientes a 5 tipos potenciales nuevos. Tres de ellos (GC01, GC08 y GC23) pudieron ser secuenciados completamente y fueron oficialmente designados HPV-156, HPV-157 y HPV-158, respectivamente. El análisis filogenético los confirmó como nuevos miembros del género Gama-PV. El HPV-156 cumple con los criterios taxonómicos para ser considerado el prototipo de una nueva especie (menos del 71% de identidad nucleotídica respecto a los tipos representantes de cada especie dentro del género). El HPV-157 pertenecería a la especie Gama-1 mientras que el HPV-158 estaría filogenéticamente relacionado a la especie Gama-12. En conclusión, este trabajo describe una estrategia versátil y con mayor sensibilidad que los métodos de amplificación convencionales para fragmentos largos y permitió identificar y caracterizar 3 nuevos virus del género Gama-PV. Uno de ellos, HPV-156, sería el prototipo de una nueva especie. La aplicación de esta estrategia para otros géneros de la familia Papillomaviridae contribuiría a completar la taxonomía y a dilucidar el rol de estos virus en las infecciones que cursan en distintos epitelios.