Optimización de la capacidad hidrolítica de la serin- b- lactamasa KPC mediante evolución molecular dirigida”

SORAYA S. BOSCH; ALEJANDRO J. VILA; PABLO E. TOMATIS

Congreso; SAB 2011- XL Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2011

Desde los años 40`s los antibióticos β‐lactámicos se utilizan de manera comercial. Su uso indiscriminado ha llevado al desarrollo de resistencia por parte de los microorganismos. El mecanismo más importante de resistencia bacteriana a antibióticos β‐lactámicos es la expresión de proteínas denominadas β‐lactamasas, que hidrolizan el enlace amida del anillo β‐lactámico, inactivándolo. Desde que los antibióticos β‐lactámicos se incorporaron en el uso clínico, las β‐ lactamasas han co‐evolucionado con ellos. Los carbapenemes son los antibióticos de “último recurso” para el tratamiento de infecciones serias causadas por bacterias Gram negativas multi‐resistentes. La adquisición de β‐lactamasas carbapenemasas que hidrolizan carbapenemes ha resultado en la mayor amenaza a la utilización clínica de estos compuestos. Se conocen dos tipos generales de β‐lactamasas: metalo‐β‐ lactamasas y las serin β‐lactamasas . La primera de las serin β‐lactamasas con capacidad de hidrolizar carbapenemes que se describió fue la denominada KPC, por Klebsiella pneumoniae carbapenemasa 2. Estas serin carbapenemasas son únicas en su clase, ya que a diferencia de las más caracterizadas serin‐β‐lactamasas TEM y SHV, las KPC poseen un amplio perfil de sustrato. Son capaces de hidrolizar no solo penicilinas y cefalosporinas de espectro extendido, sino también carbapenemes. Incluso, las KPC son resistentes a los inhibidores de serin‐β‐lactamasas de uso clínico 3. En el presente trabajo se propone tratar de optimizar la eficiencia hidrolítica de la lactamasa KPC‐2, de alta prevalencia clínica. De esta manera, se intenta generar conocimiento que permitan racionalizar los mecanismos moleculares mediante los cuales esta enzima puede aumentar la resistencia frente a los antibióticos β‐lactámicos. En lugar de estudiar la relación secuencia‐estructura‐función en proteínas mediante mutantes racionales, generaremos mutantes al azar empleando la técnica combinatorial denominada Evolución Molecular Dirigida 4,5. Como herramienta de estudio se construyó el plásmido pK18KPC‐2 Se procedió con un esquema de mutagénesis al azar y selección esquematizado en . Primeramente se generaron mutantes al azar de KPC utilizando amplificación por PCR en presencia de análogos de dNTPs, obteniendose el BM1. Luego se realizó una selección, aplicando Neutral Drift, obteniéndose el BM2. A estas mutantes seleccionadas se les aplicó la metodología de DNA Shuffling (introduce el evento de recombinación homóloga in vitro) obteniéndose el BM3. Se seleccionaron clones mutantes que crecieron a concentraciones de antibióticos superiores a las de la cepa con la KPC silvestre. Se obtuvo las CIMs para dichos clones. Los mismos fueron secuenciados y se ubicó en la estructura de la proteína KPC donde se localizaban las mutaciones encontradas en los clones seleccionados. A su vez, se puso a punto la sobreexpresión y purificación de la enzima KPC .