ESTUDIO DE LOS MECANISMOS QUE CONTRIBUYEN A LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL ONCOSUPRESOR DISC LARGE, BLANCO DE LAS ONCOPROTEÍNAS E6 DE HPV ONCOGÉNICOS.

MARZIALI, F, CAVATORTA. AL, VALDANO, M, FACCIUTO, F Y GARDIOL, D.

Ciudad del Este

Jornada; XIX Jornadas de Jóvenes Invetigadores; 2011

Asociación de Universidades Grupo Montevideo -

Los HPV infectan células epiteliales y datos epidemiológicos han demostrado que juegan un rol causal en el desarrollo de cáncer anogenital. Las proteínas E6 derivadas de HPV de alto riesgo interaccionan con la proteína celular oncosupresora Disc Large (DLG1), estimulando su degradación por el mecanismo dependiente de ubiquitina. DLG1 constituye el primer blanco reportado de las oncoproteínas E6 que interviene en los mecanismos de control de la polaridad y proliferación celular y en el mantenimiento de la arquitectura de los tejidos. Sin embargo, los mecanismos que regulan la expresión génica de DLG1 no han sido completamente caracterizados. En este sentido, nos propusimos analizar los mecanismos de regulación transcripcional del oncosupresor DLG1, desconocidos hasta el momento, considerando que alteraciones en la expresión de esta proteína podrían favorecer el desarrollo oncogénico incluso en lesiones asociadas a infecciones por HPV. En primera instancia, clonamos y estudiamos funcionalmente la región promotora de DLG1. A posteriori, y mediante el uso de técnicas de amplificación rápida de los extremos del cADN identificamos un evento de splicing alternativo en la región 5’ no traducible (5’UTR) del ARNm de DLG1, generándose dos transcriptos con 5’UTR diferentes, que hemos denominado short y large. En la forma large se pudo detectar la presencia de un upstream ORF que se pierde en la forma short debido al splicing y que reduce la eficiencia de traducción de un marco abierto de lectura clonado corriente abajo. De acuerdo a las observaciones descriptas, se plantea la hipótesis de que el splicing identificado en la 5’UTR  de hDLG se trata de un mecanismo adicional de regulación de sus niveles de expresión proteica. Por lo tanto, alteraciones de la expresión diferencial de las formas alternativas de 5’UTR, con diferentes eficiencias de traducción, dentro del pool total de ARN mensajero de hDLG en distintos tipos de tumores, podrían contribuir a la disminución de expresión reportada y la consecuente carcinogénesis. Para abordar este tema se utilizaron células de distintos tipos de tejidos y dentro de una misma clase trabajamos con células normales, inmortalizadas y transformadas como modelo in vitro del proceso de progresión maligna. Luego se cuantificaron los niveles de los transcriptos short y large utilizando técnicas de transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) cuantitativas optimizadas previamente, utilizando cebadores específicos que permiten la amplificación de cada especie de 5´UTR con metodología de PCR en tiempo real, usando el gen de succinato deshidrogenasa como gen de referencia interna. Los resultados arrojaron una disminución en la relación short large con el avance del proceso de progresión maligna, por lo que la expresión diferencial de las formas alternativas de 5´UTR podría ser un mecanismo de regulación de los niveles proteicos del oncosupresor hDLG. Estos estudios contribuyen al entendimiento de los mecanismos que regulan la expresión de la proteína de adhesión celular DLG1.