Estudio de los mecanismos que contribuyen a la regulación de la expresión del oncosupresor Disc Large, blanco de las oncoproteínas E6 de HPV oncogénicos

CAVATORTA, ANA LAURA; FACCIUTO FLORENCIA; BUGNON VALDANO MARINA; MARZIALI, FEDERICO; GARDIOL, DANIELA

Villa Giardino, Córdoba

Jornada; Estudio de los mecanismos que contribuyen a la regulación de la expresión del oncosupresor Disc Large, blanco de las oncoproteínas E6 de HPV oncogénicos; 2010

SAV

Los HPV infectan células epiteliales y datos epidemiológicos han demostrado que juegan un rol causal en el desarrollo de cáncer anogenital. Las proteínas E6 derivadas de HPV de alto riesgo interaccionan con la proteína celular oncosupresora Disc Large (DLG1), estimulando su degradación por el mecanismo dependiente de ubiquitina. DLG1 constituye el primer blanco reportado de las oncoproteínas E6 que interviene en los mecanismos de control de la polaridad y proliferación celular y en el mantenimiento de la arquitectura de los tejidos. Sin embargo, los mecanismos que regulan la expresión génica de DLG1 no han sido completamente caracterizados. En este sentido, nos propusimos analizar los mecanismos de regulación transcripcional del oncosupresor DLG1, desconocidos hasta el momento, considerando que alteraciones en la expresión de esta proteína podrían favorecer el desarrollo oncogénico incluso en lesiones asociadas a infecciones por HPV. En primera instancia, clonamos y estudiamos funcionalmente la región promotora de DLG1. A posteriori, y mediante el uso de técnicas de amplificación rápida de los extremos del cADN identificamos un evento de splicing alternativo en la región 5’ no traducible (5’UTR) del ARNm de DLG1, generándose transcriptos con dos 5’UTR diferentes. Mediante ensayos de RT-PCR pudimos demostrar que ambas formas de 5’UTR de DLG1 se expresan en distintas líneas celulares. Experimentos de luciferasa demostraron que la secuencia 5’ UTR de DLG1 que contiene el exón alternativo (5’UTR DLG1 Large), disminuye la eficiencia de traducción de un ORF clonado corriente abajo. Posteriormente, analizamos si la presencia de un codón ATG adicional (uATG), presente en la versión 5’UTR DLG1 Large podría estar contribuyendo a esta menor eficiencia de traducción observada. Por ensayos de mutagénesis de este uATG y ensayos de luciferasa demostramos que la presencia de dicho uATG, en el exón alternativo, podría ser responsable de la diferencia de eficiencias de traducción observadas para ambas versiones de 5’UTR DLG1. Por otro lado, nos propusimos analizar si las diferentes 5’UTRs podrían regular la estabiblidad de los ARNm de DLG1. A través de análisis de real time RT-PCR y tratamiento de las células con Actinomicina D, observamos que no existían diferencias significativas a nivel de la estabilidad de ambos transcriptos. Por ultimo, a través de análisis bioinformáticos determinamos que la versión Large de DLG1 5’UTR presenta una estructura secundaria significativamente estable que podría estar contribuyendo con la menor eficiencia de traducción, validando los resultados obtenidos por ensayos de luciferasa. Estos estudios contribuyen al entendimiento de los mecanismos que regulan la expresión de la proteína de adhesión celular DLG1, así como de las alteraciones en sus patrones de expresión observadas en lesiones asociadas a HPV y en otros tumores.