¿Cómo puede el termosensor DesK sentir frío?

INDA, MARÍA EUGENIA; CYBULSKI, LARISA; DE MENDOZA, DIEGO

Córdoba

Workshop; 1er Workshop Argentino de Biofísicoquímica de Proteínas; 2011

Universidad Nacional de Córdoba

¿Cómo puede el termosensor DesK sentir frío? Inda Ma. Eugenia, Cybulski Larisa E., de Mendoza Diego Instituto de Biología Molecular y Celular -CONICET- Universidad Nacional de Rosario-Argentina. inda@ibr.gov.ar Introducción: Los termosensores son proteínas integrales de membrana involucrados en muchos roles fisiológicos tales como la quimiotaxis, el remodelado de la membrana, y la percepción de presión y dolor. Nuestro termosensor DesK, de Bacillus subtilis, es una histidina quinasa de cinco pasos transmembrana capaz de detectar cambios físicos en la membrana que le permite a la bacteria adaptarse a las variaciones de la temperatura. Sin embargo, hasta el día de hoy el mecanismo por el cual el dominio transmembrana (TM) percibe y transmite la señal de temperatura se desconoce. Para estudiar el mecanismo de sensado, se diseñó una quimera que  captura en un único segmento TM (compuesto por los primeros 17 aminoácidos del TM1 y los 14 residuos C-terminales del TM5 fusionado a DesK citoplasmática) la capacidad de sensado de DesK completa (5 TM), por lo que se lo llamó sensor mínimo de DesK (SM-DesK). El extremo N-terminal de DesK presenta un inusual grupo de aminoácidos hidrofílicos (Q9, K10 y N12, motivo T “thirsty”) cercanos a la interfase lípido-agua que podría actuar como “switch” molecular. Se ha demostrado por análisis de mutaciones sitio dirigidas en SM-DesK que este motivo de la interfase controla la detección de la señal: el reemplazo de los aminoácidos hidrofílicos por aminoácidos hidrofóbicos en el motivo T (LALA-SM-DesK), lleva a una pérdida de la actividad quinasa; el aumento del estrés hidrofílico al enterrar la lisina una posición (LK5-SM-DesK) o el agregar una lisina extra (KK-SM-DesK), resulta en un aumento de la actividad quinasa; la inserción de cuatro valinas en el medio del TM1, de manera que el motivo T alcance el ambiente acuoso a cualquier temperatura (4V-SM-DesK), lleva a una pérdida de la actividad quinasa. Sugerimos entonces que es el espesor de membrana el factor que determina el estado de señalización del sensor de temperatura dictando el nivel de hidratación de este motivo hidrofílico metaestable [1]. Objetivo: Entender el novedoso mecanismo que dispara la activación de DesK. Resultados: En este trabajo, con el fin de extrapolar esta hipótesis a la proteína completa, analizamos estas mismas mutaciones en el TM1 de DesK. La mutante 4V-DesK sigue inactiva como quinasa, corroborando la importancia de la localización del motivo T en la interfase para la detección de la señal. Sin embargo, al reemplazar este motivo por aminoácidos hidrofóbicos (LALA-DesK) se incrementa la actividad quinasa considerablemente; lo mismo se observa al reemplazar sólo la lisina (K10L-DesK) o una arginina ubicada en la interfase del TM2 por un residuo hidrofóbico (R54L-DesK). Finalmente, al aumentar la carga del motivo T en la mutante KK-DesK, vemos una pérdida total de actividad quinasa. Por otro lado, también vimos un aumento en la actividad quinasa al aumentar el potencial de membrana por efecto osmótico. Conclusiones: Al comparar los efectos de las mutaciones sobre ambas proteínas, hace resurgir la pregunta: ¿cómo pueden estos aminoácidos hidrofílicos determinar la interconversión de la actividad quinasa a fosfatasa de DesK? Evidentemente, estos aminoácidos ubicados en la interfase lípido-agua son clave en la percepción de la señal. Sin embargo, en la proteína salvaje intervienen otras interacciones entre los segmentos TM que potencian o  disminuyen la actividad del termosensor independientemente del estimulo de la temperatura. Del balance de la compleja interacción entre estos aminoácidos hidrofílicos con otras regiones de la misma proteína y con el entorno, DesK resuelve su estado de activación.  [1]Cybulski LE , Martín M , Mansilla MC , Fernández A , de Mendoza D . Membrane thickness cue for cold sensing in a bacterium. Curr Biol. 2010 Sep 14;20(17):1539-44. 2010