“Relación de la proteína E6 derivada de Papilomavirus humanos de alto riesgo con la pérdida de polaridad celular en los procesos carcinogénicos”

BUGNON VALDANO MARINA; FACCIUTO FLORENCIA; ANA L. CAVATORTA; GARDIOL DANIELA

Villa giardino

Encuentro; XXX Reunion Anual Cientifica Sociedad Argentina de Virologia; 2010

Sociedad Argentina de Virologia Division de la Asociacion Argentina de Microbiologia

Las proteínas E6 y E7 derivadas de Papilomavirus humanos (HPV) de alto riesgo son claves en el desarrollo del cáncer cervical. E6 interfiere con la función de proteínas involucradas en el control de la polaridad y adhesión celular que contienen motivos denominados PDZ. Entre ellas, E6 estimula la degradación del oncosupresor Disc Large (hDLG) presente en las uniones celulares adherentes. Hemos reportado que la expresión de hDLG está disminuida en carcinomas cervicales asociados a HPV, y que los factores transcripcionales Snail se unen a la región promotora de hDLG reprimiendo su actividad. Análisis bioinformáticos de la región promotora demostraron la presencia de sitios de unión a otros factores, entre ellos SP-1. Para analizar la función de SP-1 sobre la regulación transcripcional de hDLG, construimos un vector de expresión de SP-1 apto para células eucariotas. Mediante ensayos de transfección e inmunofluorescencia (IF), demostramos la expresión correcta a partir de dicho vector y la localización nuclear de Sp1. Además, mediante ensayos de luciferasa y experimentos de co-transfección evaluamos su función sobre el promotor de hDLG, demostrando un efecto activador. Asimismo, por IF, correlacionamos los niveles endógenos de SP-1 con los reportados para hDLG en distintas líneas celulares. Por otro lado, quisimos identificar nuevos blancos de la proteína E6 de HPV relacionados con las uniones tight (UT). Más aún, se consideró que la polaridad celular también implica una correcta distribución de los lípidos fosfatidilinositol fosfatos (PIP) que interaccionan con proteínas PDZ presentes en dichas uniones. En este sentido, evaluamos el efecto de la proteína E6 de HPV de alto riesgo sobre la expresión y distribución de la proteína asociada a UT: PAR3. Observamos que la localización de PAR3, predominantemente asociada a membrana, se ve modificada ante la expresión de E6 en células epiteliales. Además, por ensayos de IF y mediante transfecciones transientes, observamos que la expresión de E6 de HPV de alto riesgo se ve asociada a una redistribución del PIP 4,5- bifosfato (PIP2) hacia citoplasma, lo que no ocurre en el caso de E6 de bajo riesgo. Más aún, pudimos divisar una localización netamente asociada a membrana de dichos PIP2 en distintas líneas celulares, excepto para el caso de HeLa (que expresa la oncoproteína E6), donde observamos una disminución en membrana y una distribución de tipo puntillado en el citoplasma.hDLG reprimiendo su actividad. Análisis bioinformáticos de la región promotora demostraron la presencia de sitios de unión a otros factores, entre ellos SP-1. Para analizar la función de SP-1 sobre la regulación transcripcional de hDLG, construimos un vector de expresión de SP-1 apto para células eucariotas. Mediante ensayos de transfección e inmunofluorescencia (IF), demostramos la expresión correcta a partir de dicho vector y la localización nuclear de Sp1. Además, mediante ensayos de luciferasa y experimentos de co-transfección evaluamos su función sobre el promotor de hDLG, demostrando un efecto activador. Asimismo, por IF, correlacionamos los niveles endógenos de SP-1 con los reportados para hDLG en distintas líneas celulares. Por otro lado, quisimos identificar nuevos blancos de la proteína E6 de HPV relacionados con las uniones tight (UT). Más aún, se consideró que la polaridad celular también implica una correcta distribución de los lípidos fosfatidilinositol fosfatos (PIP) que interaccionan con proteínas PDZ presentes en dichas uniones. En este sentido, evaluamos el efecto de la proteína E6 de HPV de alto riesgo sobre la expresión y distribución de la proteína asociada a UT: PAR3. Observamos que la localización de PAR3, predominantemente asociada a membrana, se ve modificada ante la expresión de E6 en células epiteliales. Además, por ensayos de IF y mediante transfecciones transientes, observamos que la expresión de E6 de HPV de alto riesgo se ve asociada a una redistribución del PIP 4,5- bifosfato (PIP2) hacia citoplasma, lo que no ocurre en el caso de E6 de bajo riesgo. Más aún, pudimos divisar una localización netamente asociada a membrana de dichos PIP2 en distintas líneas celulares, excepto para el caso de HeLa (que expresa la oncoproteína E6), donde observamos una disminución en membrana y una distribución de tipo puntillado en el citoplasma. CONCLUSIONES En conclusión hemos profundizado el análisis de la regulación transcripcional de hDLG demostrando que el factor transcripcional Sp1 tiene un efecto activador sobre su expresión. Por otra parte, encontramos que PAR3 sería un nuevo blanco de la oncoproteína E6 y esta interacción resultaría en cambios en su localización. E6 también estaría implicada en la deslocalización de PIPs, cuya correcta ubicación es fundamental para el mantenimiento de la polaridad celular. En conjunto, todos estos estudios indican que E6 podría interferir durante el proceso carcinogénico con el establecimiento de la polaridad ápico-basal.En conclusión hemos profundizado el análisis de la regulación transcripcional de hDLG demostrando que el factor transcripcional Sp1 tiene un efecto activador sobre su expresión. Por otra parte, encontramos que PAR3 sería un nuevo blanco de la oncoproteína E6 y esta interacción resultaría en cambios en su localización. E6 también estaría implicada en la deslocalización de PIPs, cuya correcta ubicación es fundamental para el mantenimiento de la polaridad celular. En conjunto, todos estos estudios indican que E6 podría interferir durante el proceso carcinogénico con el establecimiento de la polaridad ápico-basal.