Elementos de ARN que regulan la Replicación del Virus del Dengue

FILOMATORI CV; IGLESIAS G; VILLORDO S; GAMARNIK AV

Huerta Grande, Córdoba

Congreso; XXIX Reunión Científica Anual; 2009

Sociedad Argentina de Virología

El virus del dengue (DENV) pertenece a la familia Flaviviridae. Su genoma es una molécula de ARN simple cadena de polaridad positiva de 11 kb, que contiene un único marco de lectura abierto flanqueado por las regiones 5´ y 3´ no codificantes (UTR). Los extremos 5´ y 3´ UTR contienen dos pares de secuencias complementarias (UAR y CS) capaces de mediar la interacción RNA-RNA de largo alcance, la cual lleva a la circularización del genoma del DENV. La amplificación del ARN viral es catalizada por una ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por el genoma viral (NS5). El objetivo de nuestro trabajo es entender el mecanismo por el cual la NS5 inicia la síntesis de ARN. Estudios previos de nuestro laboratorio nos permitieron proponer el primer modelo para explicar la síntesis de ARN de un flavivirus. Según el modelo, la NS5 se une a un elemento promotor ubicado en el extremo 5´ del genoma del DENV (Stem Loop A o SLA) y luego, a través de la interacción RNA-RNA entre los extremos del genoma, es transferida al sitio de iniciación en el extremo 3´. Con el objeto de estudiar la interacción del SLA con NS5 realizamos ensayos de protección de RNasas. Moléculas de ARN del 5´UTR sintetizadas in vitro fueron incubadas con la NS5 purificada y digeridas con una RNasa específica de simple cadena. Los productos sirvieron de molde para una reacción de transcripción reversa usando como cebador un oligonucleótido fluorescente. Con esta técnica identificamos que en el SLA hay un loop superior y un loop lateral que participan en la interacción con NS5. Para estudiar el mecanismo por el cual el SLA promueve la síntesis de ARN introdujimos mutaciones en dichos elementos y analizamos in vitro tanto su interacción con NS5 como su capacidad para activarla. Para evaluar la interacción realizamos ensayos de retraso de la movilidad electroforética (EMSA) y para estudiar el proceso de activación empleamos un protocolo de medida in vitro de actividad polimerasa que utiliza moléculas de ARN exógenas y la preparación de polimerasa purificada. Con estos estudios observamos que moléculas de ARN con mutaciones específicas en el SLA conservan intacta su capacidad de asociación a la polimerasa viral pero son incapaces de promover la síntesis de ARN. Por otra parte, con el fin de estudiar los requerimientos para la iniciación de la síntesis de ARN en el extremos 3´ del genoma, utilizamos un ensayo in vitro de actividad polimerasa que depende tanto del elemento promotor SLA como de los elementos de circularización. Con este ensayo observamos que, debido a su estructura compacta, el extremo 3´ del virus no es usado como molde para la síntesis de ARN. Sin embargo, cuando los extremos del genoma interaccionan a través de las secuencias 5´-3´UAR dicha estructura se desarma, permitiendo que los nucleótidos terminales del genoma se encuentren accesibles para la polimerasa viral.