Función de la región hipervariable del 3'UTR del virus del dengue

SERGIO VILLORDO; EUGENIA BARDOSSY; ANDREA GAMARNIK; JUAN CARBALLEDA; CLAUDIA FILOMATORI

Ciudad de Buenos Aires

Jornada; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016

Sociedad Argentina de Virología

El virus del dengue (DENV) es un miembro de la familia Flaviviridae y, como el resto de losflavivirus, tiene un genoma de ARN de polaridad positiva y simple cadena deaproximadamente 11000 nucleótidos. El genoma contiene un único marco de lecturaabierto flanqueado por las regiones 3´ y 5´ no codificantes (UTR) que son altamente estructuradas y que cumplen funciones importantes durante la replicación viral. El extremo 5´ no codificante (5´UTR) se pliega en un Stem Loop de 70 nucleótidos capaz de promover específicamente la síntesis de ARN viral. El extremo 3´ no codificante (3´UTR) abarca los últimos 450 nucleótidos y contiene cinco estructuras definidas: dos Stem Loops (SLI y SLII), dos dumbbells (DBI y DBII) y el 3´ Stem Loop terminal. Además, justo río abajo del codón determinación de la traducción, y antes del comienzo de la primera estructura (SLI), contiene una secuencia desestructurada e hipervariable (HVR) de 35 nucleótidos, particularmente enriquecida en nucleótidos de adenina. La variabilidad en secuencia y longitud de la HVR ocurre tanto a nivel de serotipos como de genotipos de DENV, pero se desconoce si existe relación entre esta variabilidad genotípica y el fenotipo viral. Particularmente, los genotipos Americanos de DENV contienen una deleción de 10 nucleótidos en la HVR y no se han relacionado con casos graves de fiebre hemorrágica por DENV. Sin embargo, hasta el momento se desconoce la función de la HVR durante la replicación viral. Para estudiar los requerimientos de la HVR diseñamos, en el contexto del clon infeccioso de DENV, una serie de mutantes virales que (i)disminuyen gradualmente la longitud de la HVR, (ii) modifican su secuencia,(iii) alteran el porcentaje de bases nitrogenadas, e (iv) interponen estructuras estables en diferentes posiciones. Transfectamos las moléculas de ARN viral obtenidas por transcripción in vitro, en células crecidas en cultivo y evaluamos la replicación viral mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta. Para evaluar distintas etapas del ciclo viral, incorporamos las mutaciones en un virus reportero desarrollado en nuestro laboratorio. La medida de la actividad de luciferasa a distintos tiempos post-transfección nos permitió evaluar los procesos de traducción y síntesis de ARN viral.Mediante este abordaje pudimos concluir que se requieren al menos 20 nucleótidos en la HVR para asegurar una eficiente replicación viral. Además,cambios en la secuencia y/o la proporción de adeninas en esta región no modifican la replicación viral. Por otra parte, la presencia de elementos estructurados río abajo del codón de terminación de la traducción retrasa significativamente la replicación, tanto en células de mamífero como en células de mosquito. Estos resultados sugieren que la HRV podría tener una función de "espaciador",  que es dependiente de su longitud e independiente de su secuencia. En conjunto, nuestros resultados proporcionan nueva información acerca de las estructuras del 3´UTR que modulan la replicación viral.