Manipulación del clon infeccioso del virus Chikungunya para estudiar la replicación viral en los distintos hospedadores

EUGENIA BARDOSSY; DIEGO ALVAREZ; CLAUDIA FILOMATORI

Ciudad de Buenos Aires

Jornada; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016

Sociedad Argentina de Virología

El virus Chikungunya (CHIKV) pertenece al género alfavirus. Su ciclo natural incluye a mosquitos del género Aedes como vectores para la transmisión a humanos. Por lo tanto, el virus debe desarrollar estrategias para replicar eficientemente en estos dos ambientes. Es posible que tanto factores virales como celulares, así como la interacción entre éstos, modulen la replicación del CHIKV. Entre los factores virales, se cree que las regiones no codificantes del genoma viral jugarían un papel regulador del ciclo viral y de la citopatogenicidad. Sin embargo, hasta el momento se desconocen las funciones específicas de estos elementos del genoma. La región 3' no codificante del genoma viral (3'UTR) es muy heterogénea en longitud y secuencia. Esta diversidad sugiere que esta región evoluciona rápidamente y la convierte en un interesante objeto de estudio. A pesar de su heterogeneidad, el 3'UTR de los alfavirus comparte una misma estructura general, con repeticiones cortas desecuencia (DRs, por direct repeats), una secuencia conservada de 19-24 nucleótidos de longitud y una cola de poly(A). El número y la secuencia de las DRs dependen del linaje viral y se deben, respectivamente, a eventos de duplicación y a la incorporación de mutaciones que permitan la replicación viral en nuevos ambientes. En nuestro laboratorio nos proponemos estudiar el requerimiento de estructuras y secuencias en 3'UTR de CHIKV para la replicación viral en células de mamífero y mosquito. Para ello, disponemos de los clones infecciosos de dos aislamientos de CHIKV: (i)  el  de la Isla La Reunión y (ii) el de las Islas del Caribe, responsables de los brotes recientes en Europa y América, respectivamente. Mediante la utilización de este sistema de genética inversa podemos introducir deleciones o mutaciones en los diferentes elementos del genoma viral y estudiar el efecto de las mismas sobre la replicación viral en células crecidas en cultivo. Para identificar los requerimientos del 3'UTR diseñamos virus recombinants con (i) deleciones individuales de las DRs y (ii) mutaciones que modifiquen la secuencia y/o (iii) la estructura de los elementos del 3'UTR. Por medio de una transcripción in vitro sintetizamos moléculas de ARN del genoma viral, que luego transfectamos en células de mamífero o mosquito crecidas en cultivo. De esta manera, se inicia el ciclo de replicación viral y es posible recuperar virus infecciosos a partir del sobrenadante de las células transfectadas. Para evaluar la infectividad viral optimizamos ensayos de formación de placas de lisis, RT-PCR en Tiempo Real e inmunofluorescencia indirecta.