IIBBA   05544
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOQUIMICAS DE BUENOS AIRES
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Medición de la actividad del canal de cloruro CFTR, deficiente en fibrosis quística, mediante la sonda fluorimétrica SPQ, sensible al ión cloruro
Autor/es:
MARÍN, MARÍA C; VALDIVIESO, ANGEL G; TAMINELLI, GUILLERMO L; TEIBER, MARÍA L; PAGANO, ELEONORA S; SANTA COLOMA, TOMÁS A
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; LIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2008
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Investigación Clínica
Resumen:
552 (56) MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL CANAL DE CLORURO CFTR, DEFICIENTE EN FIBROSIS QUÍSTICA, MEDIANTE LA SONDA FLUORIMÉTRICA SPQ, SENSIBLE AL IÓN CLORURO. M C Marin 1 2 3, A G Valdivieso 1 2 3, G L Taminelli 1 2, M L Teiber 1 2, E S Pagano 1 2 4, T A Santa Coloma 1 2 3 4 1Fundación Instituto Leloir; 2Programa de Investigaciones Biomédicas, Facultad de Ciencias Médicas, Pontificia Universidad Católica Argentina UCA; 3Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-UBA; 4Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires-CONICET. La Fibrosis Quística (FQ) se caracteriza por un defecto en el transporte de cloruro (Cl-) mediado por el canal CFTR. Actualmente, la actividad del CFTR se mide mediante microscopia de fluorescencia o electrofisiología, calculando el promedio de los valores obtenidos en células individuales. La medición no es sencilla, requiere equipos costosos y numerosas determinaciones. El objetivo de este trabajo fue medir la actividad del canal de Cl- CFTR en un conjunto de cientos de miles de células simultáneamente, de forma sencilla, rápida y con respuestas a tratamientos en tiempo real. Con este fin utilizamos un espectrofluorímetro Hitachi F-2000 y la sonda fluorescente SPQ (6-methoxy-N-[3-sulfopropyl] quinolinium). Se utilizaron como modelo células T84 controles y tratadas con los inhibidores de la actividad del CFTR glibenclamida (100mM) y CFTR(inh)-172 (5µM). Luego de ser cultivadas sobre cubreobjetos en medio libre de suero por 24hs, las células fueron incubadas con el fluoróforo SPQ (6mM), durante 16-20 hs. Para la medición se utilizó una celda conectada a una bomba peristáltica, agitador magnético y baño termostático. Se realizó una medición basal y luego se agregó una mezcla estimulante de la actividad del CFTR (AMPc 200µM, IBMX 200µM e isoproterenol 20µM). Como se esperaba, se observó una respuesta significativamente menor al estímulo en las células tratadas con los inhibidores del CFTR. Los resultados obtenidos muestran que la espectrofluorimetría con SPQ permite la medición de la actividad del canal de Cl- CFTR de manera sensible, sencilla y reproducible. Asimismo, en observaciones preliminares se detectaron oscilaciones en la concentración de Cl-, hecho que sugiere una sincronización de todas las células en la expulsión y recaptación de Cl-, algo que hasta ahora no había sido detectado con los otros métodos, probablemente por falta de sensibilidad. Agradecimientos: subsidios UBA (X-156), ANPCyT (PICT 13907), becas del CONICET (MCM, ESP y AGV)) y UCA (GLT).