Función de elementos del 3'UTR del virus del dengue sobre la replicación viral en células de mamífero y mosquito.

FILOMATORI C; VILLORDO S; GAMARNIK A

Buenos Aires

Simposio; 4to Encuentro Internacional sobre enfermedades olvidadas.; 2013

Fundación Mundo Sano

El ciclo natural del virus del dengue (DENV) incluye a humanos y mosquitos del género Aedes. En líneas celulares de mosquito el virus mantiene una infección persistente, en tanto que en líneas de mamífero se observa tras la infección efecto citopático y muerte celular. Es posible que tanto factores virales como celulares sean responsables de la replicación diferencial. Entre los primeros se ha propuesto que las regiones no codificantes del genoma viral jugarían un papel regulador del ciclo viral y de la citopatogenicidad. El 3´UTR abarca los últimos 450 nucleótidos y puede dividirse en cuatro dominios estructurales definidos (VR, A2, A3 y 3´SL). La región variable (VR) contiene cinco subregiones (A1.1, A1.2a, A1.2b, A1.3 y A1.4) y representa la región más heterogénea en cuanto a la longitud y conservación de secuencia entre diferentes aislamientos del virus del dengue. Estudios preliminares realizados en nuestro laboratorio muestran que la deleción del dominio VR provoca un retraso de la replicación viral en células de mamífero, mientras que aumenta significativamente la replicación viral en células de mosquito. Esta observación nos motivó a profundizar el estudio de la VR con el propósito de caracterizar la replicación del virus del dengue en distintos hospedadores. Para ello introdujimos mutaciones o deleciones en los elementos de la VR mediante técnicas de genética reversa. Las moléculas de ARN infeccioso fueron transfectadas en líneas celulares de mosquito y mamífero crecidas en cultivo. En cada caso evaluamos la replicación viral mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta en función del tiempo. Mediante esta técnica observamos que la deleción de la subregión A1.3 del dominio VR aumenta significativamente la replicación viral en células de mosquito, mientras que la deleción de A1.2a o A1.2b atenúa la replicación en células de mamífero.. Con el propósito de definir si los efectos observados en las células de mosquito se deben a elementos de la estructura y/o la secuencia de A1.3 diseñamos una serie de mutaciones puntuales que modifican la secuencia y/o estructura de A1.3 y las incorporamos en un virus reportero desarrollado en nuestro laboratorio (R-DENV). La medida de actividad luciferasa a distintos tiempos post-transfección nos permite evaluar las distintas etapas del ciclo viral. Mediante ésta técnica pudimos concluir que los nucleótidos del loop superior (Top loop) de A1.3 son responsables de los efectos observados en las células de mosquito, y que se requiere el apareamiento de éstos nucleótidos con los nucleótidos de la base de A1.3 con la formación de un pseudoknot para que estos efectos se manifiesten. Por otra parte, estudiamos la producción de ARNs virales subgenómicos (ARNsf) mediante la técnica de Northern Blot. Estas moléculas se originarían por degradación incompleta de las moléculas del genoma y corresponderían al extremo 3´UTR del genoma viral. Nuestros resultados muestran que las mutaciones de la subregión A1.3 que otorgan al DENV un beneficio replicativo en células de mosquito; también modifican el tamaño de los ARNsf generados.   En su conjunto, estos los estudios nos permitieron caracterizar la función de la VR en distintos hospedadores, identificar las estructuras y/o secuencias responsables de los efectos observados y relacionar estos efectos con la acumulación de moléculas virales de ARN subgenómico.