Estrategia de desarrollo de una biblioteca de anticuerpos de dominio único de llama (VHH) para la identificación de marcadores de melanoma metastásico humano.

LACREU M, MAC KEON S, MORDOH J, URRUTIA M

Mar del Plata

Congreso; LV SAIC; 2011

SAIC

Desarrollo de una biblioteca de anticuerpos de dominio único de llama (VHH) contra antígenos  de la superficie de células de melanoma humano para la futura identificacion de marcadores  de melanoma metastático humano.  Es sabido que una vez que el melanoma metastatiza a distancia, no hay tratamiento confiable. Los intentos de inmunoterapia, quimioterapia y terapia radiante no han dado buenos resultados hasta el momento. Sin embargo si el diagnóstico es temprano, el melanoma se cura por simple escisión quirúrgica. Aún no se han desarrollado Ac monoclonales contra melanoma.  Por esto es que nos proponemos obtener anticuerpos de dominio único contra antígenos de superficie de melanoma humano, con el propósito de identificar nuevos marcadores moleculares característicos de los sitios de metástasis. Las llamas poseen, además de las inmunoglobulinas convencionales, una fracción importante de Acs que carecen de cadena liviana. El sitio de combinación de estos Acs está formado por un solo dominio, la región variable de la cadena pesada o VHH. Estos fragmentos de Acs se unen al Ags mediante loops protruyentes, por lo que suelen reconocer epitopes cóncavos a diferencia de los anticuerpos convencionales. Con el fin de construir una biblioteca de anticuerpos de dominio único de llama (VHH) contra antígenos  de la superficie de células de melanoma humano se  inmunizaron llamas con líneas de melanoma humano metastasico (LMHM).  Se estudiaron  en 9 LMHM la presencia de mRNA de ABCB5 mediante RT-PCR, obteniéndose 3 líneas positivas: XY3, XX6 y XY8, las cuales coincidieron con ser las más agresivas en cuanto al daño que le produjeron al paciente. Una mezcla de membranas de estas 3 LMHM son las que se utilizaron como inmunogeno. Se inmunizaron 2 llamas cada 20 días con una mezcla de extractos de membranas de las 3 LMHM conteniendo 1.5mgr de proteínas totales/inmunización y se analizaron las respuestas séricas luego de la 1er, 2da y 3er inmunización. Se observó que la respuesta aumentaba a medida que se avanzaba con la inmunización y luego de la 3er inmunización se obtuvo una respuesta con un titulo final  mayor a 1/1000. Se realizó una 4ta inmunización y a partir de 50ml de sangre periférica se aislaron los mononucleares y posterior RNA. Mediante PCR con primers específicos se amplificaron el pool de VHHs del tamaño esperado que se insertarán en el vector de display en fagos para construir la biblioteca de VHHs a ser seleccionada contra las 3 LMHM. También se estudio la presencia de los marcadores CD63, CD133 y CD271 (NGFR) en las 3 LMHM utilizadas mediante la técnica de citometría de flujo. Se observaron que las 3 líneas son positivas para CD63 y  negativas para CD133. Las líneas XX6 y XY8 dieron positivas para el marcador CD271 confirmándose su marcación de membrana mediante la observación al miscroscopio. Estos resultados nos permiten concluir que las llamas han desarrollado respuesta contra antígenos naturales de membrana lo cual no es trivial dado que al encontrarse los mismos en fragmentos de membrana podrían haberse desnaturalizado y no ser reconocidos en su estado nativo. Por otro lado la marcación de membrana del CD271 en 2 de las 3 LMHM testeadas, reportado en bibliografía como marcador de células madres cancerosas.